Dissecção e coloração dos ovários Pupal drosófila
Summary
O ovário de Drosophila é um sistema excelente modelo para estudar o desenvolvimento de nicho de células-tronco. Embora métodos para dissecando larvas e adultos ovários foram publicados, dissecções de ovário pupal requerem diferentes técnicas que não tenham sido publicadas em detalhe. Aqui nós esboçamos um protocolo para dissecar, coloração e montagem ovários pupal.
Abstract
Ao contrário de ovários de Drosophila adultos, pupal ovários são relativamente difíceis de acessar e examinar devido a suas pequenas tamanho, translucidez e encerra dentro de um caso de pupa. O desafio de dissecação pupal ovários também reside na sua localização física dentro a pupa: os ovários estão rodeados por células de gordura corporal dentro do abdômen pupal, e essas células de gordura deve ser removidas para permitir a adequada anticorpos. Para superar estes desafios, este protocolo utiliza personalizadas pipetas Pasteur para extrair células de gordura corporal do abdome pupal. Além disso, uma lamela septada é usada no lugar de um tubo de microcentrifugadora durante o processo de coloração para melhorar a visibilidade das pupas. No entanto, apesar de estas e outras vantagens das ferramentas utilizadas no presente protocolo, execução bem sucedida destas técnicas ainda pode envolver vários dias de prática devido ao pequeno tamanho dos ovários pupal. As técnicas descritas neste protocolo poderiam ser aplicadas para experimentos de curso do tempo em que os ovários são analisados em vários estágios de desenvolvimento pupal.
Introduction
Investigação em células estaminais usando Drosophila ovários expandiu-se, amplamente, desde a primeira documentação de uma célula-tronco nicho1,2,3,4. Acompanhar o desenvolvimento de ferramentas de genética linhagem rastreamento, ovário de Drosophila dissecções foram comumente usadas para estudar as linhagens de células-tronco e sinalização de vias que regulam a manutenção de células-tronco, proliferação e destino no nicho de células-tronco. Conhecimento destas vias de sinalização pode produzir insights sobre causas potenciais de cânceres que se originam de células-tronco aberrante atividade5,6,7. Recentemente também mostrou que as células-tronco somáticas no ovário drosófila , conhecidas como células-tronco do folículo (FSCs), fortemente se assemelham a mamíferos células-tronco intestinais em muitos aspectos de sua organização8. Por esta razão, Drosophila ovários são um sistema de modelo altamente útil para estudar o comportamento de células-tronco.
Enquanto os ovários de larvas e adultos oferecem pistas para o desenvolvimento precoce de células-tronco e células-tronco final organização no nicho, respectivamente, o ovário pupal é uma estrutura intermediária em que a linha germinativa e células somáticas reorganizar e estabelecer suas identidades 9 , 10. embora vários estudos examinaram os aspectos do desenvolvimento de tecido no ovário pupal11,10,12,13, perguntas permanecem sobre a diferenciação e organização espacial tipos de células dos ovários durante o desenvolvimento pupal. Em particular, a especificação de FSCs ocorre durante este período. Este protocolo descreve um método para dissecar e coloração pupal ovários em pontos de tempo desejado — uma técnica que pode ser usada em experimentos de curso do tempo que analisam o desenvolvimento do ovário pupal em detalhe de larval para a fase adulta.
Para explicar o tamanho pequeno, translucidez e inacessibilidade do ovário dentro do abdômen pupa pupa, este protocolo utiliza ferramentas como uma feito por pipeta Pasteur com ponta fina para remover o corpo de gordura abdominal tecido obstruindo o acesso de anticorpo para o ovários. Uma lamela clara, septada, usada durante o anticorpo que mancha oferece maior visibilidade das pupas e uma plataforma mais suave para balançar os ovários em um “Nutator”. Baseado em um protocolo para dissecções de ovário larval de Maimon e Gilboa14, uma concentração relativamente alta de Triton X-100 foi empregada nas etapas iniciais do processo de coloração para maximizar o acesso de permeabilização e anticorpo de membrana celular para a células dos ovários.
Protocol
Representative Results
Discussion
A etapa mais crítica e difícil do presente protocolo envolve a preparação de pupa ovários antes da fixação. Para garantir que os ovários, pequenos e enterrados por células de gordura corporal dentro do abdômen pupal, estão manchados suficientemente com anticorpos, é importante não só rasgar uma abertura grande no saco abdominal com fórceps, mas também extrair as células de gordura corporal que obstruem o ovários de anticorpos. Execução bem sucedida dessa etapa requer a aplicação de pressão sutil so…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pelo National Institutes of Health (RO1 GM079351 de D.K.). Agradecemos Dorothea Godt dela conselhos úteis sobre dissecações de ovário pupal, baseado no seu protocolo original. Agradecemos também a Amy Reilein por sua assistência e comentários sobre o manuscrito.
Materials
| Dumont #5 Forceps, biology | Fine Scientific Tools | 11252-20 | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-10A | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Analysis software | Carl Zeiss | Zen | |
| 9 Depression Glass Spot Plates | Pyrex | 7220-85 | |
| Pasteur pipet | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| Pasteur pipet bulb | Various vendors | ||
| Bunsen burner | Various vendors | ||
| Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| 22 x 22 mm glass coverslips No 1 | VWR | 48366-067 | |
| Dapi Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Nutator | Clay Adams | ||
| Fine brush #0, #3-#5 | Various vendors | ||
| Gilson Pipetman Starter Kit | Thomas Scientific | F167300 | Contains p20, p200, p1000 pipettors |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS |
| Triton | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| 10x PBS | Ambion | AM9624 | Dilute to 1x PBS |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 5000121 | Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration |
| Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000) | Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum) | Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Fly vials | Denville Scientific | V9406 | |
| Cotton Balls, For Wide Vials | Genesee Scientific | 51-102W | |
| Yeast, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 101400 | |
| Fly food | Produced in laboratory | Mixture of water, brewer's yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid | |
| Male and female Drosophila flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
- Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation. Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).
- Kirilly, D., Xie, T. The Drosophila ovary: an active stem cell community. Cell Res. 17 (1), 15-25 (2007).
- Dansereau, D. A., Lasko, P. The Development of Germline Stem Cells in Drosophila. Method Mol Biol. 450, 3-26 (2008).
- Pearson, J., López-Onieva, L., Rojas-Ríos, P., Gonzáles-Reyes, A. Recent advances in Drosophila stem cell biology. Int J Dev Biol. 53, 1329-1339 (2009).
- Arwert, E. N., Hoste, E., Watt, F. M. Epithelial stem cells, wound healing and cancer. Nat Rev Cancer. 12 (3), 170-180 (2012).
- Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
- Daley, G. Q. Chronic myeloid leukemia: proving ground for cancer stem cells. Cell. 119 (3), 314-316 (2004).
- Reilein, A., et al. Alternative direct stem cell derivatives defined by stem cell location and graded Wnt signaling. Nat Cell Biol. 19 (5), 433-444 (2017).
- Eliazer, S., Buszczack, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2 (6), 45 (2011).
- Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric à brac. Development. 121 (1), 173-187 (1995).
- King, R. C., Aggarwal, S. K., Aggarwal, U. The development of the female Drosophila reproductive system. J Morphol. 124 (2), 143-166 (1968).
- Vlachos, S., Jangam, S., Conder, R., Chou, M., Nystul, T., Harden, N. A Pak-regulated cell intercalation event leading to a novel radial cell polarity is involved in positioning of the follicle stem cell niche in the Drosophila ovary. Development. 142 (1), 82-91 (2015).
- Irizarry, J., Stathopoulos, A. FGF signaling supports Drosophila fertility by regulating development of ovarian muscle tissues. Dev Biol. 404 (1), 1-13 (2015).
- Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries. J Vis Exp. (51), e2537 (2011).
- Kerkis, J. The Growth of the Gonads in DROSOPHILA MELANOGASTER. 遗传学. 16 (3), 212-224 (1931).
- Yamanaka, N., et al. Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference. Science. 341 (6150), 1113-1116 (2013).
- Bainbridge, S., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Development. 66, 57-80 (1981).
- Courdec, J., et al. The bric à brac locus consists of two paralagous genes encoding BTB/POZ domain proteins and acts as a homeotic and morphogenetic regulator of imaginal development in Drosophila. Development. 129, 2419-2433 (2002).
- Arrese, E. L., Soulages, J. L. INSECT FAT BODY: ENERGY, METABOLISM, AND REGULATION. Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2011).
- Zhang, Y., Xi, Y. Fat Body Development and its Function in Energy Storage and Nutrient Sensing in Drosophila melanogaster. J Tissue Sci Eng. 6 (1), (2014).
- Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila Ovaries. J Vis Exp. (1), e52 (2006).
