Preparação ideal de formol fixada amostras para peptídeo baseado Matrix assistida por espectrometria de massa de ionização/dessorção Laser Imaging fluxos de trabalho
Summary
Este protocolo descreve um método reprodutível e confiável para preparação de formol fixada tecido destinado a espectrometria de massa de imagens baseada em sublimação.
Abstract
O uso de laser assistida por matriz dessorção/ionização, espectrometria de massa (MALDI MSI) de imagem rapidamente expandiu-se, uma vez que esta técnica analisa uma série de biomoléculas de drogas e lipídios para os N-glicanos. Embora existam várias técnicas de preparação de amostra, detectar peptídeos formol preservados os tecidos continua a ser um dos mais difíceis desafios para este tipo de análise de espectrometria de massa. Por esta razão, temos criado e otimizado de uma metodologia robusta que preserva as informações espaciais contidas dentro da amostra, enquanto a suscitar o maior número de peptídeos ionizáveis. Nós também ter mirado para alcançar este objectivo de forma simples e rentável, eliminando assim o possível erro viés ou preparação, que pode ocorrer quando usando automatizado instrumentação. O resultado final é um protocolo reprodutível e de baixo custo.
Introduction
Espectrometria de massa de ionização/dessorção do laser assistida por matriz (MALDI MSI) de imagem tem sido utilizada como uma técnica de imagem com base para duas décadas1,2, analisando uma série de biomoléculas incluindo: lipídios3, peptídeos2 ,4, proteínas de2,5, metabólitos6,7, os N-glicanos8e moléculas sintéticas tais como drogas terapêuticas9,10. O número de publicações, demonstrando a utilidade desta técnica tem crescido significativamente ao longo da última década,6,11,12,13. Certas moléculas, como lipídios, são relativamente fáceis de analisar através de MALDI MSI, como eles ionizam facilmente devido à sua natureza química e, portanto, requerem pouca preparação prévia3. No entanto, para alvos mais difíceis, como peptídeos, as etapas necessárias para ionizar eficazmente estas moléculas são extensos e complicados geralmente14. Atualmente, existem poucas publicações que visam endereço ou demonstram reprodutibilidade nas metodologias que são utilizadas para preparar o tecido para esta técnica visual original15. Por esta razão, nós temos compilado observações e implementado otimizações em um único, fácil de implementar, metodologia que não requer pouca ou nenhuma modificação, para a análise de peptídeos formol um reticulado tecido fonte14.
Neste manuscrito, descrevemos uma metodologia reproduzível validada, de baixo custo para a detecção e mapeamento espacial de peptídeos, gerados a partir de congelados fixada em formol (FFF) e fixada em formol parafina (FFPE) cortes histologicos. Esta metodologia não exigem ou dependem de qualquer instrumentação especializada3. Especificamente, abordamos os muitos aspectos especializados da preparação da amostra necessário para analisar os peptídeos; etapas como antígeno recuperação16 e revestimento de matriz. Nosso protocolo também utiliza equipamento barato e reagentes, tornando esta metodologia acessível para uma comunidade mais alargada, que seria incapaz de pagar os aparelhos robóticos alternativo17.
O raciocínio por trás do desenvolvimento de um método de preparação de amostra manual foi dupla: em primeiro lugar, o uso de um Sublimador cria um revestimento consistente e homogêneo dos cristais de matriz que são ~ 1 µm no comprimento18, algo inatingível com pulverização mais comuns técnicas. Em segundo lugar, o conjunto relativamente pequeno de custos: o custo total do aparelho personalizado foi <$ 1500 AUD. Notamos que, em termos de custo-eficácia, o preço por exemplo é muito mais barato quando não há nenhuma maquinaria robótica envolvidos. O uso de sublimação foi relatado anteriormente, no entanto, para o melhor de nosso conhecimento, metodologias passo a passo que descrevem este processo e preparação da amostra não tem sido relatadas nem descritas na literatura.
Este protocolo destina-se a auxiliar os pesquisadores que têm acesso a um espectrômetro de massa MALDI e que têm a intenção de gerar informação espacial em relação a uma bio-molécula de interesse19. Em essência, MALDI MSI é uma forma de histológica de rastreio que não depende de anticorpos ou manchas2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo foi projetado para maximizar a geração de espécies moleculares ionizáveis, eliminando a deslocalização dos analitos. Fatores-chave envolvem usando os mesmos princípios de substituição, ao aplicar a matriz, digerindo a amostra, ou recristalização após sublimação24; ou seja, que um mesmo deposição de vapor, de matriz ou caso contrário, precisa ser criado e mantido. Pipetagem lavagens de solventes para a recristalização e digestão, uniformemente debaixo da amostra, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de reconhecer a Sydney Medical School Foundation e Fundação e Blues para o financiamento de parte deste trabalho através do seu programa de bolsa de doutorado para investigação da doença de Alzheimer e uma concessão de ARC descoberta (DP160102063), atribuído a PKW.
Materials
| Cryo Microtome | Leica | CM3050 | For preparation and section of tissue. |
| Indium Tin Oxide Microscope slides | Bruker | 8237001 | For preparation and section of tissue. |
| Coplin Jars | Sigma Aldrich | S5516 | For preparation and section of tissue. |
| Pressure Cooker | Kambrook | KPR620BSS | For preparation and section of tissue. |
| Sublimator | Chem Glass | NA | For sublimation procedure. Similar in design to the CG-3038 however it was custom made |
| Sand bath | NA | NA | For sublimation procedure. Fine grade river sand held in folded aluminium foil sourced from outside not from any specific company |
| Glass Petri Dish | Sigma Aldrich | CLS70165100 | For sublimation procedure. |
| Vacuum Pump | NA | NA | For sublimation procedure. Sourced as a spare part from an old mass spectrometer |
| Cold trap | Chem Glass | CG-4510-02 | For sublimation procedure. |
| Hot Plate | John Morris | EW-15956-32. | For sublimation procedure. |
| Plastic petri dish | Sigma Aldrich | Z717223 | For sublimation procedure. |
| 37 °C incubator | NA | NA | For sublimation procedure. Not applicable, incubator is non sterile and over 30 years old |
| Blotting paper | Sigma Aldrich | P7796 | For sublimation procedure. |
| Nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8395 | For washing of slides. |
| Acetone | Sigma Aldrich | 650501 | For washing of slides. |
| Xylene | Sigma Aldrich | 214736 | For washing of slides. |
| 100% EtOH | Sigma Aldrich | 1.02428 | For washing of slides. |
| 70% EtOH | Sigma Aldrich | NA | For washing of slides. Made in lab from 95% stock ethanol |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C2432 | For washing of slides. |
| Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | ARK2183 | For washing of slides. |
| Tris HCL pH 8.8 | Sigma Aldrich | TRIS-RO | For proteolytic cleavage. Powder made to 1M followed by equilibration with 32% HCl to PH 8.8 |
| Milli Q Ultra-Pure Water | Sigma Aldrich | NA | For proteolytic cleavage. Purification performed in house by sartorious water purification system |
| Ammonium Bircarbonate | Sigma Aldrich | A6141 | For proteolytic cleavage. |
| Trypsin | Sigma Aldrich | T0303 | For proteolytic cleavage. |
| CHCA Matrix | Sigma Aldrich | C2020 | For recrystallisation. |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 1.00029 | For recrystallisation. |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Sigma Aldrich | 302031 | For recrystallisation. |
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