Ein verbessertes Verfahren zur Sammlung von Liquor cerebrospinalis aus narkotisierten Mäuse
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine verbesserte Technik für die reichhaltige Sammlung von zerebrospinale Flüssigkeit (CSF) ohne Kontamination aus Blut. Mit größeren Musterkollektion und Reinheit können weitere Analysen mit CSF, um unser Verständnis von Krankheiten zu fördern, die das Gehirn und das Rückenmark betreffen durchgeführt werden.
Abstract
Der Liquor cerebrospinalis (CSF) ist eine wertvolle Körperflüssigkeit für die Analyse in der neurowissenschaftlichen Forschung. Es ist eines der Flüssigkeiten im engsten Kontakt mit dem zentralen Nervensystem und kann daher verwendet werden, um den kranken Zustand des Gehirns oder des Rückenmarks zu analysieren, ohne direkten Zugriff auf diese Gewebe. Bei Mäusen ist es schwer zu bekommen aus der Cisterna Magna wegen seiner guten Anbindung an den Blutgefäßen, verunreinigen die jedoch oft Proben. Die CSF-Sammlung bei Mäusen ist auch schwerlich zu sezieren und oft nur kleine Proben (maximal 5-7 µL oder weniger) erzielt werden. Dieses Protokoll beschreibt im Detail eine Technik, die über die aktuellen Methoden der Sammlung zu minimieren Kontamination aus Blut und ermöglichen die reichhaltige Sammlung von CSF (im Durchschnitt 10-15 µL gesammelt werden können) verbessert. Diese Technik kann mit anderen Dissektion Methoden für Gewebe-Sammlung von Mäusen, verwendet werden, da es keinem Gewebe während der CSF Extraktion auswirkt. So im Gehirn und Rückenmark sind mit dieser Technik nicht betroffen und bleiben intakt. Mit größeren CSF Musterkollektion und Reinheit weitere Analysen können mit dieser Flüssigkeit weiter Hilfe neurowissenschaftliche Forschung verwendet werden und Krankheiten, die das Gehirn und das Rückenmark besser zu verstehen.
Introduction
CSF ist eine wertvolle Körperflüssigkeit für die Analyse in der neurowissenschaftlichen Forschung. Die GfK besteht hauptsächlich aus Blutplasma, mit wenigen Zellen (keine roten Blutkörperchen und nur ein paar weiße Blutkörperchen) und ist fast frei von Protein. Es ist eine der Flüssigkeiten in engem Kontakt mit dem zentralen Nervensystem (ZNS) und es kann viele Elektrolyte aus dem Gehirn und Rückenmark an das periphere System übergeben. Beim Menschen, CSF Proben kann erhoben werden, um Hilfe bei der Diagnose von Krankheiten oder für Forschungszwecke in klinischen Studien als eine Lumbalpunktion (oder Lumbalpunktion) ist eine kleinere, invasive Verfahren: die CSF Flüssigkeit kann Änderungen im ZNS ohne direkt auf diese zugreifen Gewebe. So wurden in den letzten Jahren zu Forschungszwecken in der Klinik, CSF Proben von Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit und anderen Demenzerkrankungen1,2,3gewonnen. Es gibt viele Biomarker-Assays, die entwickelt wurden, mit CSF Proben möglicherweise Hilfe bei der Diagnose von Krankheiten in der Klinik2,3. Allerdings gibt es viel Debatte über die Zuverlässigkeit dieser Tests zu konsistenten, sensible Ergebnissen um gezielt diagnostizieren Krankheit4,5. So, gibt es ein großer Bedarf an der Entwicklung besserer Assays und Ziele, die im Liquor gefunden werden können, um Hilfe bei der Herstellung ein Standardverfahren zur diagnose von neurodegenerativen Erkrankungen mit größere Sensitivität und Spezifität. Aufgrund der potenziellen Bedeutung des CSF Humanproben bei Krankheit ist die Sammlung von CSF von Nagetieren in der neurowissenschaftlichen Forschung auch von Interesse.
Mäuse sind wichtige Tiere in biologischen und medizinischen Forschung und für die Prüfung von möglichen therapeutischen Verbindungen und Proof-of-Concept-Studien vor der klinischen Studien am Menschen erlauben. Jedoch bei Mäusen ist es schwierig, CSF Proben wegen seiner Nähe zum Gehirn in ein kleines Tier zu erhalten, da die übliche Methode der CSF-Sammlung bei Mäusen ist es über die Cisterna Magna, eine Öffnung zwischen dem Kleinhirn und der dorsalen Oberfläche des der Medulla Oblongata zu erhalten. Dies führt zu Schwierigkeiten in CSF Proben zu sammeln, da dieser Bereich schwierig zu sezieren und in unmittelbarer Nähe für Blutgefäße, erhöht die Gefahr der Kontamination von Blutzellen. Aufgrund dieser Schwierigkeiten die meisten Forscher erhalten nur eine kleine Menge von CSF Analyse (in der Regel als 5-7 µL angegeben) und die Verunreinigung von CSF Proben von Blutkörperchen ist ein Hauptanliegen für Analysen6,7,8 , 9. Blut Verunreinigungen kann Ergebnisse zu verschleiern und nicht wirklich spiegeln den Stand des ZNS. Darüber hinaus kann begrenzt Probe Forschung auswirken, da die üblichen Menge gesammelt von Mäusen nur einer Messung (in doppelt oder dreifach) reicht mit Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA). CSF Proben sind somit in der Regel aus mehreren Mäusen gebündelt, um genügend Blut mehrere Tests ausgeführt haben. Entwicklung eines Protokolls für die reichlich, unberührten Sammlung von CSF von Mäusen ist sehr erwünscht und werden bei der Verbesserung der neurowissenschaftlichen Forschung mit Nagetieren vorteilhaft.
In diesem Protokoll, eine Technik für die reichlich (durchschnittlich 10-15 µL) Sammlung von CSF von narkotisierten Mäuse wird ausführlich beschrieben und verbessert auf eine derzeit bekannte Methode der CSF Sammlung, Kontamination von Blut10zu minimieren. Ein robustes Protokoll für CSF Sammlung hilft bei der Entwicklung von CSF-basierte Biomarker Assays, die verwendet werden könnte, um Hilfe bei der Diagnose von Krankheiten sowie die Verbesserung der Forschung über die Mechanismen, die Erkrankungen des ZNS zugrunde liegen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt im Detail eine Technik, die auf aktuellen Methoden10 der CSF-Sammlung zu minimieren Kontamination aus Blut und ermöglichen die reichhaltige Sammlung von CSF verbessert (durchschnittlich ~ 10-15 µL erzielt werden) von Mäusen. Wenn die Kapillare Spitze zu brechen, die Spitze der Kapillare sollte nicht zu klein (wie damals die CSF wird extrahiert werden sehr langsam) sein oder zu groß (wird nicht fein genug, um die CSF sammeln und Gewebe in der Kapillare eingereicht we…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81650110527, 81371400) und National Key Basic Research Programm of China (2013CB530900) unterstützt.
Materials
| Chloral hydrate (used as anesthetic) | Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd. | 30037517 | CAS number 302-17-0. |
| Dissecting scissors | 66 vision technology | 54002 | |
| Dissecting curved forceps | 66 vision technology | 53072 | |
| Dissecting straight forceps | 66 vision technology | 53070 | |
| Mouse adapter (with ear bars) | Made in-house. | N/A | Similar equipment available from World Precision Instruments. |
| Dissecting microscope | Meiji Labax | Model 15381 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Magnetic base for micromanipulator | Kanetec | MB-K | |
| Glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | Model P-1000 | |
| Syringes (1ml) | Tansoole | 02024692 | For 1ml. |
| Microtubes (1.5ml) | Axygen | MCT-150-C | |
| Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free | Calbiochem | 539134 | |
| Human Aβ42 ELISA kit | Invitrogen | KHB3441 | |
| Piping (teflon tubing) | World Precision Instruments | MMP-KIT | Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe. |
| Mini centrifuge | Tiangen Biotech | OSE-MC8 | |
| Cotton buds | Obtained from any household store/pharmacy. | N/A |
References
- Anoop, A., Singh, P. K., Jacob, R. S., Maji, S. K. CSF Biomarkers for Alzheimer’s Disease Diagnosis. Int. J. Alzheimers. Dis. 2010, 1-12 (2010).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat. Rev. Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Schoonenboom, N. S. M., et al. Cerebrospinal fluid markers for differential dementia diagnosis in a large memory clinic cohort. Neurology. 78 (1), 47-54 (2012).
- Molinuevo, J. L., et al. The clinical use of cerebrospinal fluid biomarker testing for Alzheimer’s disease diagnosis: A consensus paper from the Alzheimer’s Biomarkers Standardization Initiative. Alzheimer’s Dement. 10 (6), 808-817 (2014).
- Fagan, A. M. CSF biomarkers of Alzheimer’s disease: impact on disease concept, diagnosis, and clinical trial design. Adv. Geriatr. 2014, 1-14 (2014).
- Ramautar, R., et al. Metabolic profiling of mouse cerebrospinal fluid by sheathless CE-MS. Anal. Bioanal. Chem. 404 (10), 2895-2900 (2012).
- Liu, L., Herukka, S., Minkeviciene, R., Vangreon, T., Tanila, H. Longitudinal observation on CSF Aβ42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice. Neurobiol. Dis. 17 (3), 516-523 (2004).
- Schelle, J., et al. Prevention of tau increase in cerebrospinal fluid of APP transgenic mice suggests downstream effect of BACE1 inhibition. Alzheimer’s Dement. , (2016).
- You, J. -. S., Gelfanova, V., Knierman, M. D., Witzmann, F. A., Wang, M., Hale, J. E. The impact of blood contamination on the proteome of cerebrospinal fluid. Proteomics. 5 (1), 290-296 (2005).
- Liu, L., Duff, K. A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse. J. Vis. Exp. (21), (2008).
- Maia, L. F., et al. Changes in amyloid-β and Tau in the cerebrospinal fluid of transgenic mice overexpressing amyloid precursor protein. Sci. Transl. Med. 5 (194), 194re2 (2013).
- Oshio, K. Reduced cerebrospinal fluid production and intracranial pressure in mice lacking choroid plexus water channel Aquaporin-1. FASEB J. , (2004).
