標準化され、再現性のある前脳型人間から脳オルガノイドの生成誘導多能性幹細胞

1. iPSC 集計の生成 IPSC の植民地から単一セルの単一層文化の生成 基底膜抽出 (BME) コーティング 6 ウェル プレートを準備します。2-3 h の 4 ° C で氷の上の BME を解凍、冷たいダルベッコ変更イーグル培地 F12 で希釈 (DMEM F12; 1:50 希釈)、1 ml/BME 薄めたのもプレートをカバーし、4 ° C で一晩プレートを保管 培地を吸引し、植民地を 4 分間室温 (RT) の PBS で 0.5 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の孵化前に二度リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の 0.5 mM EDTA の 6 ウェル プレートの少なくとも 2 井戸のまま iPSC 植民地を洗ってください。EDTA 溶液を吸引し、F12 DMEM 培地 5 mL を皿の底を離れてそれらを洗浄することにより植民地を注意深く取り外します。15 mL チューブにそれらを収集し、遠心分離 (常温 1,200 x gで 4 分) によってそれらをペレットします。注:市販繊維芽細胞から書き換え Ips が正常に使用される10をされています。 上清を吸引し、37 ° C で 6 分間細胞解離試薬の 500 μ L で iPSC コロニーを孵化させなさい 細胞懸濁液残りのセルのクラスターを単一のセルに分割する 1 mL ピペットで数回軽く上下をピペットで移しなさい。 細胞解離試薬を希釈する細胞懸濁液に DMEM f12 キーの 4 つの mL を追加します。 室温 4 分 1,200 x gで下セルをスピンします。 5 μ M と iPSC 培の 2 mL の細胞を再懸濁します Y-27632 と種子コーティング BME 6 ウェル プレートの 1 つのウェルに細胞します。注:単一細胞単層 iPSC 培養のための材料表で指定された iPSC 媒体を使用します。 次の日、Y-27632 を欠けている新鮮な iPSC 媒体に媒体を置き換えます。この時点から、Ips が 100% 合流まで毎日変化して培地、細胞の培養を続けます。細胞株および開始の井戸の confluency、によって 2-4 日間かかります。 一度合流、通路、Ips。培地を吸引し、細胞の細胞解離試薬の 500 μ L を適用します。 37 ° C で 5 ~ 10 分の細胞をインキュベートします。セルをデタッチするプレートを優しく揺する。 井戸からセルを洗浄して DMEM f12 キーの 2 ml と 15 mL チューブでそれらを収集します。5 mL の容量の DMEM f12 キーを追加します。 RT で 4 分間 1,200 x gで細胞を回転し、上清を吸引します。 セルをシード iPSC 培 5 μ m で、BME で 1:4 の比率を 1:2 に Y-27632 コーティング 6 ウェル プレート (2 mL/媒体の井戸)。 引き続き 2-5 日間の培養し、毎日 Y-27632 を欠けている iPSC 媒体を変更します。一度合流、通路 Ips (手順 1.1.4-1.1.8)。注:IPSC 集計の生成のための細胞は培養条件に適応するためにそれらを使用する前に材料のテーブルで指定された iPSC 媒体における単分子膜として少なくとも 2 通路の Ips の文化. 単層 iPSC 培養する際 iPSC の集計の生成、70-90% 合流。注:単一細胞はストレスになりやすい、培養条件に適応した iPSC 解離および集計するときに細胞死に 。単層 iPSC 培養分化の証拠と典型的な多能性の形態を表示する必要があります。マイコ プラズマ汚染のため定期的に文化をテストします。マイコ プラズマ無料 iPSC 文化でのみ動作します。 6 ウェル プレートの 1 つの井戸から培養液を吸引し、細胞の細胞解離試薬の 500 μ L を適用します。 37 ° C で 5 ~ 10 分の細胞をインキュベートします。セルをデタッチするプレートを優しく揺する。 井戸から細胞を洗う DMEM f12 キーの 2 ml と 15 mL チューブでそれらを収集します。10 mL の容量の DMEM f12 キーを追加します。 細胞数、細胞懸濁液から 25 μ L を取るし、トリパン ブルーに死んだ細胞の 25 μ L でそれをミックスします。カウントのチャンバーを用いた生細胞をカウントします。 15 mL チューブに細胞懸濁液から十分な細胞 (iPSC 集計あたり 4,500 細胞) を収集します。 RT で 4 分間 1,200 x gで細胞を回転し、上清を吸引します。 50 μ m iPSC 培の適切なボリュームで細胞を再懸濁します Y-27632 150 μ L あたり 4,500 の生きているセルを取得します。注:Y-27632 の高濃度を使用して (50 μ M) は、Ips の生存のために重要です。 各 150 μ L をプレート低添付ファイル 96 ウェルの U 下部のプレートし、37 ° C、5% CO2でインキュベーターで配置。注:IPSC 集計を生成、するときは、少なくとも 6 organoids が 20 (セクション 5 を参照) の日に品質管理のため必要であることを検討してください。 2. 前方の次の誘導 4 X、10 X 力レンズを用いた培養顕微鏡下で毎日 iPSC 凝集体の形態変化を注意深く監視します。日 1、明確な国境を持つ細胞凝集塊を観察します。37 ° C、5% CO2でインキュベーターで培養 iPSC 集計続けます。注:死んだ細胞/ウェル数は正常であり、organoid 世代は影響しません。 IPSC 集計 2 日目から始まって、そして下部細胞凝集塊を妨げないで媒体の約 2/3 を軽く吸引して一日おきと続きをフィードします。Y-27632 を欠けている iPSC 媒体の追加の 100 μ L を追加します。注:4-6 日以内、細胞凝集塊は直径 350 450 μ m をされ、滑らかなエッジを展示します。 この段階でプール セルは N2 サプリメント (レバレッジ)、B27 サプリメント (1: 100)、グルコース (0.2 mg/mL)、繰返し DMEM f12 キーを含む皮質誘導培地でカット 100 μ L ピペット チップで低添付ファイル 6 cm 皿 (最大 20 集計/皿) に集約します。アデノシン一リン酸塩 (キャンプ; 0.15 μ G/ml)、0.5% 非必須アミノ酸 (NEAA) 1 %l-アラニル-L-グルタミン、ヘパリン (10 μ G/ml)、LDN 193189 化合物 (180 nM)、A83 01 (500 nM)、および wnt シグナル応答 1 (IWR-1) の阻害剤 (10 μ G/ml)。皮質誘導培地に 6 cm の皿にそれらを転送した後 3 日を変更することによって、細胞凝集塊をフィードします。 4 X 力レンズを用いた培養顕微鏡下皮質誘導中に形態学的変化を注意深く監視します。注:皮質誘導培地で 4-5 日後細胞凝集塊の端は神経外胚葉性の分化を示す表面で明るくが開始されます。この段階では、偽重層上皮の放射状組織が現れます。BME マトリックスに細胞集塊を埋め込むにはセクション 3 に進んでください。 3. マトリックス足場で集計神経外胚葉性の埋め込み BME 2 3 十分な量で分注の原液 BME のための 4 ° C で氷の上を解凍します。 埋め込みのプロシージャのプラスチック パラフィン フィルム シートを準備します。4 cm × 4 cm 大で滅菌はさみを使用してプラスチック パラフィン フィルム、プラスチックの部分を入れ、部分 100 μ L のヒント、空 100 μ L チップ トレイ上フィルムをパラフィン、プラスチック パラフィン フィルム シートに小さなえくぼが (1 di が作成されるよう手袋をはめた指で押してカット例/セルの集計が必要)。70% エタノールでプラスチック パラフィン膜をきれいにし、紫外線照射 (電力: 15 ワット、波長: 435 nm) 30 分間閉じた無菌ベンチの下。 各セルの集計を 100 μ L カット 1.5-2 mm 径で開くプラスチック パラフィン フィルム シートの 1 つのディンプルに転送します。融合した場合は、2 つの集計セル、区切っていないが、1 つのディンプルに一緒に転送します。 優しくノーカット 100 μ L のピペット チップを使用して細胞凝集塊を囲む媒体を吸い出しなさい。注:これは凝集体を損傷するため、先端に細胞集塊を吸うこと注意ください。 原液の BME の 40 μ L を各セルの集計に追加します。 各セルの集計、BME の真ん中には、ノーカットの 100 μ L ピペット チップを使用してドロップ位置。注:ピペット チップの開発神経を害することのない非常に注意します。 慎重に 10 cm シャーレに滅菌鉗子 (または別の十分な細胞培養ディッシュ) プラスチック パラフィン フィルム シートを転送し、固める BME を許可するように 15 〜 20 分のためのインキュベーターに皿を置きます。 一方、皮質誘導培地 5 mL を含む低添付ファイル 6 センチメートルの皿を準備します。 BME の重合後プラスチック パラフィン フィルム シートからセルの集計を含む液滴を削除します。滅菌鉗子を使用してプラスチック パラフィン フィルムを裏返して、穏やかにわずかに傾いた細胞凝集塊を絞る (約 30 °) 低添付ファイル 6 cm 皿プラスチック パラフィン フィルム シートから水滴が落ちるまで。1 つの 6 cm 皿に最大 16 細胞凝集塊を転送します。 37 ° C で細胞凝集塊をインキュベートし続ける 4. 神経外胚葉性から前脳型オルガノイドの生成の集約します。 BME マトリックスへの埋め込み後の 1 日は、傾斜角 5 ° ・ 14 rpm、携帯文化のインキュベーターでインストールとロッキング細胞文化シェーカーに organoid 培養皿を置きます。 毎日オルガノイドを監視します。均質な上皮細胞内ループのような構造は、BME マトリックスへの埋め込み後徐々 に開発します。 上皮細胞内ループ構造が表示されているときは、媒体を organoid 分化培 DMEM-F12 N2 サプリメント (レバレッジ)、B27 サプリメント (1: 100)、グルコース (0.2 mg/mL)、キャンプ (0.15 μ g/mL)、0.5% に変更 NEAA、1 %l-アラニル L グルタミンインスリン (2.5 μ g/mL) 差別化目的の時点に到達するまで 3-4 日おき organoid 分化培地を交換します。その後、修正 organoids (セクション 5 を参照)。注:時折、組織はループ構造を持たない光半透明組織の芽を示すことがあります。これは理想的ではありませんがこれは皮質構造の開発を影響されていません。オルガノイドは、40 日間 organoid 分化培地で培養することができます。拡張された文化期間 (40-100 日) organoid 分化培地が 1:50 で補完することができます組織の複雑さを増加する BME と BDNF と GDNF が神経細胞の生存と成熟14,15を許可します。 5. 固定と前脳型オルガノイドの検証 検証、20 日目で 6 オルガノイドを収集します。MRNA の分離および PCR 解析 3 オルガノイドを使用します。3-3.5 mm の開口部をもつ固定とシーケンシャルの免疫細胞化学的解析のカット 1 mL ピペット チップを使用して PBS を含む 24 ウェル プレートに追加 3 オルガノイドを転送します。 慎重に PBS を吸引し、5 mL のピペットを使用して新鮮な PBS に置き換えることによって 2 回、オルガノイドを洗います。冷たい 4% パラホルムアルデヒド (PFA) (pH 7.4) で 15 分間オルガノイドを修正します。注意:PFA は知られている人間の発癌物質であることに注意してください。ニトリル手袋を身に着けている化学発煙のフードで、すべての作業を行う必要があります。安全眼鏡を着用することをお勧めします。ホルムアルデヒドは角膜に不可逆的な損傷を引き起こすことができます。 PFA を慎重に吸引し、洗浄 3 回 10 分間室温 PBS を使用します。 PBS を 30% ショ糖液に置き換える (wt/巻、PBS ベース) 退避オルガノイドを許可する 4 ° C で試料を保存と。さらに処理まで最大 7 日間オルガノイドを格納できます。 1 日固定後は、前約 1:50 セクショニング手順中、オルガノイドの可視化を許可するように 10 分でトリパン ブルー色素を追加することによって脱水オルガノイドを染色します。 7.5% ゼラチン wt/巻、PBS で 10% ショ糖を含む埋め込みメディアの準備、それが液体になるまでそれを 75 ° C に暖かい。 埋め込みメディアを 30% ショ糖液を交換し、オルガノイドを平衡に 15 分間加熱プレート (60 ° C) 24 ウェル プレートを転送します。 埋め込みメディアの層で埋め込み型の底をカバーし、重合を氷の上に置きます。 埋め込みに 24 ウェル プレートから organoids 金型重合埋め込みメディアを含む転送を追加追加埋め込み媒体上、オルガノイド覆われている 100% エタノール/ドライアイス風呂 (凍結にすぐに型を置く温度は、-30 ~-50 ° C の間でなければなりません) ショック凍結する少なくとも 1 分。 ドライアイスを一時的に鉗子とそれら-80 ° c または直接続行セクショニングどちらのストアを持つ金型を配置します。 20 μ m の厚みで収集 Cryosection オルガノイドのセクションの順序スライド (シーケンシャル取り込み) 追跡を維持、顕微鏡スライドのセクション。-80 ° C で保存または直接免疫組織化学的染色を行う前にいくつかの時間、スライド上で乾燥するセクションを許可します。