Sintesi di particelle d'oro rivestite di polimeri 10-nm funzionalizzate per il Targeting di endotelio e Drug Delivery

1. preparazione o approvvigionamento di soluzioni Stock (che va conservato a temperatura ambiente o congelate fino all’utilizzo) Preparare una soluzione stock di 1 M di idrossido di sodio (NaOH) sciogliendo 400 mg NaOH in 10 mL di acqua distillata a temperatura ambiente, e mescolando bene i materiali.Nota: Acqua ultrapura è definita come acqua senza impurità quali polveri, batteri, nucleasi, ioni o tracce di sostanze organiche. Un sistema di depurazione viene utilizzato per ottenere l’acqua ultrapura, con conseguente sua resistività di mΩ·cm fino a 18,2, che indica una bassa contaminazione anionica. Non è raccomandato l’uso di acqua ultrapura in bottiglia disponibile in commercio. D’ora in poi, questa acqua ultrapura si riferisce come acqua, se non diversamente specificato. Preparare una soluzione stock di 6M NaOH sciogliendo 2,4 g di NaOH in 10 mL di acqua e conservare la soluzione a temperatura ambiente. Preparare una soluzione stock di 250 mM di acido cloroaurico (HAuCl4) sciogliendo 1 g di secchi HAuCl4 a 10,16 mL di acqua. Diluire 1 mL di 250 mM HAuCl4 con 9 mL di acqua per ottenere la concentrazione di lavoro di 25 mM HAuCl4. Conservare la soluzione di4 HAuCl a temperatura ambiente. Preparare un tampone di carbonato di 0.1 M a pH 8.8, bicarbonato di sodio 84 mg in 10 mL di acqua di dissoluzione e regolando il pH a 8,8 aggiungendo 6 M NaOH dal punto 1.2. Conservare il tampone di carbonato a temperatura ambiente. Mescolare 20 mL di tetrazolium compound, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium sale (MTS), con un agente di stabilizzazione, fenazina ethosulfate (PES) (Vedi Tabella materiali). Conservare la miscela MTS/PES nelle aliquote (per un massimo di 10 cicli di gelo-disgelo) a-20 ° C nel buio. 2. sintesi dei nuclei di nanoparticelle d’oro Preparare una soluzione diluita di THPC aggiungendo 12 µ l 80% THPC in acqua per 1 mL di acqua in un tubo del microcentrifuge a temperatura ambiente. Fissare un pallone a fondo rotondo da 100 mL sopra il centro di una piastra magnetica. Versare 45 mL di acqua nel pallone e mescolare l’acqua a 300 giri/min utilizzando un piccolo uovo-a forma di ancoretta magnetica. Aggiungere 0,5 mL di NaOH M 1 e 1 mL di soluzione diluita di THPC. Continuare a mescolare la miscela di reazione vigorosamente per 5 min. Continuare a mescolare il composto e aggiungere 2 mL di 25 mM HAuCl4 soluzione. Il colore della miscela cambierà da giallo a marrone scuro in pochi secondi, che indica che la formazione di THPC capped AuNPs con una carica negativa. Mescolare il composto per altri 15 minuti consentire la formazione completa dei nuclei d’oro. 3. aggiunta del polimero Corona intorno le nanoparticelle d’oro Durante il periodo di 15 min descritto al punto 2.3, preparate il PEG soluzioni sciogliendo ciascuno dei seguenti in 1 mL di acqua in flaconcini di vetro da 4 mL: 30 mg NH2-PEG-SH; 7,5 mg m-PEG-SH; 7,5 mg COOH-PEG-SH.Nota: Le concentrazioni risultante dovrebbero essere 8,8 M NH2-PEG-SH, 3,75 M m-PEG-SH e 3,75 M COOH-PEG-SH. Dopo la riduzione della velocità dell’agitatore della soluzione nella beuta di fondo tondo a 100 giri/minuto, aggiungere che le soluzioni di PEG per la soluzione di THPC capped AuNPs goccia a goccia. Continuare a mescolare il composto delicatamente durante la notte, a temperatura ambiente, per garantire un’efficiente rimozione di THPC e la sostituzione di PEG. Per il prossimo 72 h, è necessario utilizzare una membrana di cellulosa taglio peso molecolare di 12-14 kDa per Dializzare la miscela agitata contro un secchio di 4 L d’acqua agitata a 60 giri/min. Legare le estremità delle membrane da clips di dialisi e trasferire la soluzione tramite pipetta.Nota: Questo processo di dialisi con la membrana cut-off di 12-14 kDa rimuove solo PEG non reagita, THPC e altri reagenti chimici, di diffusione lungo un gradiente di concentrazione. Per mantenere alto gradiente di concentrazione e promuovere la diffusione di continuo, è necessario cambiare l’acqua ogni 2 h per le prime 6 ore e ogni 6-12 h per le rimanenti 66 h.Nota: Lo scopo di questa acqua cambia pianificazione è quello di ospitare la rapida diffusione che si verifica all’inizio a causa della concentrazione inizialmente elevata all’interno del campione. Il processo di dialisi descritto sopra foglie, la soluzione di nanoparticelle semipurificata, perché le nanoparticelle, precipitati, aggregazioni e altre impurità di grandi dimensioni non può passare attraverso i pori della membrana di cut-off di 12-14 kDa. Filtrare la soluzione semipurificata nanoparticella in una provetta conica da 50mL utilizzando un filtro da 0,2 µm siringa per rimuovere i rimanenti precipitati, aggregazioni e altre impurità di grandi dimensioni. Collocare la provetta conica in un congelatore a-80 ° C e lasciare agire la soluzione purificata PEGylated AuNP (PEG-AuNP) di congelare per circa 5 ore. Utilizzare un congelamento essiccatore per lyophilize il PEG-AuNP purificata. Memorizzare il secco, purificata PEG-AuNP a 4 ° C fino all’utilizzo. 4. coniugando fluorofori usando l’estere N-Idrossisuccinimide (NHS) sul NH2 gruppi su PEG-AuNP Fissare un pallone a fondo rotondo da 50 mL sopra il centro di una piastra magnetica. Riempire il pallone con 18 mL di acqua e mescolare l’acqua a 100 rpm usando un’ancoretta magnetica a forma di uovo. Pesare 2 mg del liofilizzato PEG-AuNP in una provetta conica da 4 mL, utilizzando una scala di benchtop di alta precisione. Utilizzare una pistola antistatica per eliminare le cariche elettrostatiche e l’attaccamento della polvere PEG-AuNP alla superficie del tubo. Aggiungere 2 mL di acqua nella provetta. Versare i 2 mL di soluzione di PEG-AuNP nel pallone fondo tondo per ulteriore ricostituzione in un totale di 20 mL di acqua. Continuare a mescolare il composto a 100 rpm usando un’ancoretta magnetica a forma di uovo. Aggiungere 1 mL di 0,1 M, pH 8.8 carbonato buffer per i 20 mL del ricostituito AuNP contenuta in un matraccio a fondo arrotondato. Continuare a mescolare. Aggiungere 5 µ l di estere NHS fluorescente di 10 mg/mL in solfossido dimetilico.Nota: Qualsiasi colorante fluorescente può essere utilizzato in questo processo. Mescolare il PEG fluorescente durante la notte. Tenerlo a temperatura ambiente e coperto di stagnola. Per il prossimo 72 h, rimuovere fluorofori in eccesso utilizzando il protocollo descritto al punto 3.3. Brevemente, Dializzare la miscela agitata con un secchio di 4 L di acqua e una membrana di cellulosa taglio peso molecolare di 12-14 kDa. Cambiare l’acqua ogni 2 h per le prime 6 h e ogni 6-12 h per le rimanenti 66 h. Prelevare 1 mL della soluzione PEG-AuNP fluorescente purificata, da utilizzarsi per caratterizzazione descritto nella sezione 5. Congelare e lyophilize la soluzione rimanente per ottenere nanoparticelle fluorescenti nella forma in polvere per conservazione a 4 ° C, come descritto nei passaggi 3.5-3.7. Utilizzare un filtro per siringa 0,2 µm per sterilizzare e rimuovere qualsiasi potenziale precipitati una volta ricostituiti per applicazioni della coltura delle cellule. 5. caratterizzazione di nanoparticelle fluorescenti PEGylated oro Utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per visualizzare il nucleo delle nanoparticelle di oro e quantificare le dimensioni Goccia 10 µ l della soluzione PEG-AuNP fluorescente purificata su una griglia di carbonio rivestito maglia TEM. Dopo 5 min, è possibile utilizzare un pezzo di carta da filtro per stoppino accuratamente il liquido in eccesso lontano dal bordo della griglia TEM fino un film contenente il fluorescente che PEG-AuNPs è lasciato alle spalle. Mostra il PEG-AuNPs fluorescente a 80 kV e un ingrandimento di 50.000-150, 000. Scatta foto digitali.Nota: Solo il nucleo dell’oro sarà visibile perché la PEG non è elettrone denso il TEM. Utilizzando un software di misurazione, impostare la scala di misurazione in correlazione con la barra della scala. Calcolare il diametro di circa 20 Core d’oro e quindi determinare il diametro del nucleo oro medio.Nota: Il sistema di imaging TEM inserisce automaticamente una barra di scala sulle immagini digitali. Misurazione delle dimensioni delle nanoparticelle idrodinamico utilizzando diffusione dinamica della luce (DLS) Trasferire 1 mg di liofilizzato AuNPs rivestite con THPC in una microcentrifuga utilizzando l’approccio descritto al punto 4.2. Trasferire 1 mg di liofilizzato PEG-AuNP in un tubo separato. Aggiungere 1 mL di acqua a ciascuna provetta e trasferire ogni soluzione AuNP a un 1 mL in plastica trasparente. Disponga una provetta in un strumento DLS e misurare i diametri idrodinamici sferici utilizzando il software di analizzatore di particelle che è incorporato nel sistema liste di distribuzione. Tracciare i diametri idrodinamici misurati utilizzando un formato di istogramma.Nota: L’istogramma raggrupperà le nanoparticelle di dimensione. Il più grande gruppo delle nanoparticelle chiarirà il diametro che meglio descrive le dimensioni del AuNPs sintetizzato in questo protocollo. Conferma di fluorescenza fluorometricaNota: Il campione stesso e la cuvetta dal punto 5.2 può essere utilizzati per misurare il segnale fluorescente. Rimuovere la provetta da liste di distribuzione e inserire una spettrofluorimetro. Insieme della lunghezza d’onda di eccitazione a 633 nm e leggi la fluorescenza emessa segnali lungo un intervallo di lunghezza d’onda di 650-800 nm. Confermare che il picco è di circa 665 nm, che correla al picco di emissione per NHS.Nota: Regolare le lunghezze d’onda di eccitazione e di emissione secondo il fluoroforo utilizzato nel processo. 11 per valutare la biocompatibilità di analisi MTS In un fondo chiaro 96 pozzetti sterili per coltura trattato piastra, pipettare 100 µ l di terreno dell’Aquila per volta di Dulbecco (DMEM; completati con 10% fetale bovino del siero e l’1% penicillina/streptomicina) e 3.2 x 103 celle in ogni pozzetto.Nota: In questo studio, le cellule endoteliali del rilievo grasso di ratto sono utilizzate. Un totale di 21 pozzi vengono utilizzati per consentire per 3 repliche per ciascuna delle 7 concentrazioni differenti di nanoparticelle (Vedi punto 5.4.3 per concentrazioni specifiche di interesse). Permettono alle cellule di crescere alla confluenza in umidità e 5% CO2 controllata incubatrici a 37 ° C11. Preparare microcentrifuga individuali, ciascuna contenente 300 µ l di DMEM con nanoparticelle di varie concentrazioni. Questo studio richiede 7 diversi tubi di DMEM con le seguenti concentrazioni di PEG-AuNP: 0 µ g/mL, 10 µ g/mL, 50 µ g/mL, 100 µ g/mL, 250 µ g/mL, 500 µ g/mL e 1.000 µ g/mL. Aspirare il DMEM dal tubo. Riempire i pozzetti in triplice copia con 100 µ l di supporto DMEM contenente 0, 10, 50, 100, 250, 500 o 1.000 µ g/mL di AuNP. Consentire le cellule e le nanoparticelle co-Incubare per un periodo predeterminato di tempo, qui per 16 h. Verso la fine del periodo d’incubazione, scongelare la miscela di MTS/PES da passo 1,5. Dopo l’incubazione, aspirare il DMEM e le nanoparticelle sospese, vagamente collegate dai pozzi. Aggiungere 100 µ l di DMEM fresco insieme a 20 µ l di soluzione MTS/PES per ottenere 1:5 MTS/PES al rapporto di DMEM secondo il protocollo del produttore. Incubare le cellule con MTS/PES a 37 ° C per 2 h.Nota: Questo tempo di incubazione di 2 h è determinato dall’attività metabolica delle cellule endoteliali e può essere aumentato fino a 4 h per altri tipi di cellule. Entro il periodo di 2 h, la MTS è metabolizzato dalle cellule endoteliali in formazano colorata che si mescola con il DMEM. Biocompatibilità di PEG-AuNP e la probabilità di attuabilità delle cellule sarà dimostrati con formazan più colorata. Tossicità di PEG-AuNP e la possibilità che le cellule stanno morendo verrà mostrato con colore meno intenso. Eseguire analisi colorimetrica dei pozzetti leggendo l’assorbanza a 492 nm con un lettore di piastra compatibile. Per ogni concentrazione di nanoparticelle, calcolare l’assorbanza media da valori di assorbenza in triplice copia. Dividere l’assorbanza media per il valore ottenuto da una media di assorbanza in pozzetti contenenti nanoparticelle di 0 µ g/mL.Nota: Questi pozzi che non contengono nessun AuNPs fungono da controlli per il calcolo percentuale la vitalità cellulare in risposta al trattamento di nanoparticella amministrato in altri pozzi. Valutazione di microscopia confocal di fluorescenza dell’assorbimento delle nanoparticelle in cellule endoteliali aderente con intatto o disfunzionale glicocalice11 Seme 1.0 x 104 cellule/cm2 ratto grasso pad cellule endoteliali su lamelle di vetro sterile 12 mm e nutrire le cellule con DMEM completati con 10% fetale bovino del siero e l’1% penicillina/streptomicina. Permettono alle cellule di crescere a pieno confluency di umidità e CO2 controllata incubatori a 37 ° C, per circa 3 giorni. Aggiungere trattamenti per modificare il glicocalice, se applicabile. Ad esempio, 2 trattamenti di h delle cellule endoteliali coltivate con 2,5 x 10-6 IU eparinasi enzima degrada il glicocalice fendendo specificamente relativo componente del solfato di heparan.Nota: Glicocalice sano possa essere modellati coltivando le cellule endoteliali, come descritto al punto 5.5.1 senza l’aggiunta di enzimi di degradazione. Con il glicocalice endoteliale lasciato intatto o reso disfunzionale, incubare le cellule endoteliali con AuNPs fluorescente a 550 µ g/mL per 16 h o altro tempo desiderato. Lavare delicatamente le cellule con 2 mL di albumina di siero bovino di 37 ° C 1% in tampone fosfato salino (PBS; contenente 100 mg/L calcio e magnesio 100 mg/L). Immergere le cellule in 2 mL di 2% paraformaldeide e 0,1% glutaraldeide in PBS e permettono alle cellule di difficoltà per 30 min a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione di fissaggio aldeide e lavare le cellule con temperatura ambiente PBS per tre cicli di 5 min. Prima dell’applicazione di anticorpo primario, esporre le cellule endoteliali al siero di capra 2% in PBS per 30 min a temperatura ambiente per bloccare i siti di legame non specifico. Le cellule devono essere completamente coperti dalla soluzione bloccante. Incubare le cellule endoteliali durante la notte con l’anticorpo primario di 1% anti-eparan solfato in siero di capra 2% in PBS a 4 ° C per etichettare il componente di solfato di eparan del glicocalice. Assicurarsi che le celle fisse siano completamente a contatto con la soluzione di anticorpo. Il giorno dopo, lavare l’anticorpo con temperatura ambiente PBS per tre cicli di 10 min. Incubare le cellule endoteliali con 1:1,000 diluizione dell’anticorpo secondario fluorescente appropriato per 30 min a temperatura ambiente, in scuro o coperto con carta stagnola. Lavare l’anticorpo secondario con temperatura ambiente PBS per tre cicli di 10 min. Montare il vetrino coprioggetto su vetrini da microscopio utilizzando un mezzo di montaggio anti-dissolvenza contenente 4′, 6-diamidino-2-phenylindole, dicloridrato (DAPI) per nuclei di colorazione. Sigillare i bordi del coprivetrino con smalto. Immagine la cellula endoteliale fluorescente immunostained campioni con microscopia confocale, utilizzando canali lontano rossi, verde e blu per visualizzare i nuclei, eparan solfato glicocalice e le nanoparticelle, rispettivamente.