استجابة جذع الدماغ السمعية والخارجي الشعر خلية تسجيل المشبك تصحيح كامل الخلية في الفئران بعد الولادة
Summary
ويصف هذا البروتوكول أساليب لتسجيل استجابة جذع الدماغ السمعية من الجراء الفئران بعد الولادة. دراسة تطور وظيفي لخلايا الشعر الخارجي، يرد وصف للإجراءات التجريبية لتصحيح كامل الخلية المشبك تسجيل في عزل خلايا الشعر الخارجي خطوة بخطوة.
Abstract
خلية الشعر الخارجي واحد من هذين النوعين من الخلايا الشعر الحسي في القوقعة الثدييات. أنها تغير طول الخلايا مع مستقبلات محتملة لتضخيم الاهتزاز ضعيف لإشارة الصوت منخفض المستوى. مورفولوجيا والخاصية الكهربية لخلايا الشعر الخارجي (أوهكس) تضع في سن مبكرة بعد الولادة. نضوج خلية الشعر الخارجي قد تسهم في تطوير النظام السمعي. ومع ذلك، عملية التنمية أوهكس لم تدرس جيدا. وهذا جزئيا بسبب صعوبة قياس وظيفتها بنهج الكهربية. هدف تطوير طريقة بسيطة لمعالجة هذه المسألة المذكورة أعلاه، هنا نحن تصف بروتوكول خطوة بخطوة لدراسة وظيفة أوهكس في القوقعة حاد ينتابها من الفئران بعد الولادة. مع هذا الأسلوب، يمكننا تقييم cochlear الاستجابة للمحفزات نغمة نقية ودراسة مستوى التعبير ووظيفة بريستين موتور البروتين في أوهكس. يمكن أيضا استخدام هذا الأسلوب للتحقيق في خلايا الشعر الداخلية (إيكس).
Introduction
وظيفتين متميزتين من خلايا الشعر الحسية cochlear ضرورية لاستماع الثدييات: ميتشانويليكتريك تنبيغ (MET) واليكتروموتيليتي1،2. MET القنوات الموجودة في حزمة الشعر، إيكس (إيكس) وأوهكس تحويل الاهتزاز الصوت إلى غشاء التغييرات المحتملة، فضلا عن الإشارات الكهربائية من دوامة معصب العقدة العصبية. أوهكس تغيير طول الخلية بغشاء المحتملة وتضخيم الاهتزاز للصوت منخفض المستوى. يتم اشتقاق هذا النشاط الذي يطلق عليه اليكتروموتيليتي بريستين البروتين المحرك الموجود في الجدار الجانبي أوهكس3.
في العديد من الأنواع بما فيها القوارض، وظيفة السمع غير ناضجة في عصر ما بعد الولادة المبكرة4،5. تعذر الكشف عن لا إمكانات العمل استجابة لإشارات الصوت في القشرة السمعية قبل بداية الجلسة6،7. ودرست التنمية مورفولوجيا ووظيفة القوقعة على نطاق واسع في الماوس، وعضل، والفئران4،،من58. ميتشانوترانسدوكشن واليكتروموتيليتي من خلايا الشعر وتوضع أيضا في أوائل حقبة الحياة5.
من أجل تقييم حساسية السمع من الفئران في مختلف الإعمار ما بعد الولادة، قمنا بتطوير طريقة لاستجابة جذع الدماغ السمعية (ABR) التسجيل في الجراء الفئران. تصحيح كامل الخلية المشبك عبارة عن تقنية مثالية للتحقيق في أوهكس اليكتروفيسيولوجيكالي. ومع ذلك، مقارنة مع المشبك التصحيح المنجزة في الخلايا العصبية والخلايا الظهارية الأخرى، المعدل المنخفض لختم كامل الخلية محدودة التحقيق في اليكتروموتيليتي أوهكس معزولة.
هنا يصف لنا إجراء للتحقيق في أوهكس شكلياً واليكتروفيسيولوجيكالي في القوقعة حاد ينتابها من الفئران بعد الولادة. يمكن تعديل هذا الأسلوب لدراسة الآليات الجزيئية التي تنظم التنمية الداخلية الشعر الخلية ووظيفتها.
Protocol
Representative Results
Discussion
في فئران أصغر سنا من يوم 11، يمكن ملاحظة لا إمكانات العمل استجابة للتحفيز سليمة في القشرة السمعية6،7. ولذلك، بعد الولادة يوم 11 توصف بأنها “بداية جلسة الاستماع”10. تطوير وظيفة السمع قبل بداية جلسة الاستماع لم تدرس جيدا حتى الآن. استخدام أسلوب مماثل ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل منح من برنامج 973 (2014CB943002) والوطنية العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين (11534013, 31500841).
Materials
| Anesthetic | |||
| Pentobarbital sodium | Sigma | P3761 | 1.5% in water |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection solution | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | 2 mg/mL in L-15 |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining solutions | |||
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | PH 7.3 |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% in PBS |
| Triton X-100 | Amresco | ZS-0694 | 0.3% in PBS |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | 10000C | 10% in PBS |
| prestin antibody | Santa Cruz | SC-22694 | dil 1:200 |
| Alexa Fluor 488-conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | dil 1:600 |
| Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | dil 1:200 |
| DAPI | Solarbio | C0060 | dil 1:20 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Extracellular solution | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intracellular solution | |||
| CsCl | Sigma | 7647-17-8 | 140 mM |
| MgCl2 | Sigma | 7791-18-6 | 2 mM |
| EGTA | Sigma | 67-42-5 | 10 mM |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Osmometer | Gonotec | OSMOMAT 3000 basic | |
| Forcep | WPI | 14095 | Tweezers dumont |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | MODLE-P97 | |
| Micro Forge | Narishigen | MF-830 | |
| Mini Operating System | Sutter Instrument | MP-285 | |
| MultiClamp | Axon | 700B | |
| Low-Noise Data Acquisition System | Axon | 1440A | |
| ES1 speaker | Tucker-Davis Technologies | ||
| TDT system 3 | Tucker-Davis Technologies | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| SigGenRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| BioSigRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| jClamp | Scientific Solutions | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal | |||
| SD rat | Experimental Animal Center of Southern Medical University |
References
- He, D. Z., Zheng, J., Kalinec, F., Sacchi Kakehata, S. S. a. n. t. o. s. -., J, Tuning in to the amazing outer hair cell: membrane wizardry with a twist and shout. J Membr Biol. 209, 119-134 (2006).
- Dallos, P. Cochlear amplification, outer hair cells and prestin. Curr Opin Neurobiol. 18, 370-376 (2008).
- Zheng, J., et al. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature. 405, 149-155 (2000).
- Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
- Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. J Neurosci. 27, 13890-13902 (2007).
- Zhang, L. I., Bao, S., Merzenich, M. M. Persistent and specific influences of early acoustic environments on primary auditory cortex. Nat Neurosci. 4, 1123 (2001).
- De, V. -. S. E., Chang, E. F., Bao, S., Merzenich, M. M. Critical period window for spectral tuning defined in the primary auditory cortex (A1) in the rat. J Neurosci. 27, 180-189 (2007).
- He, D. Z., Evans, B. N., Dallos, P. First appearance and development of electromotility in neonatal gerbil outer hair cells. Hearing Res. 78, 77-90 (1994).
- Hang, J., et al. Synchronized Progression of Prestin Expression and Auditory Brainstem Response during Postnatal Development in Rats. Neural Plast. , 4545826 (2016).
- Ehret, G. Development of absolute auditory thresholds in the house mouse (Mus musculus). J Am Audiol Soc. 1, 179-184 (1976).
- Møller, A. R. . Hearing:anatomy, physiology, and disorders of the auditory system. , (2006).
- He, D. Z., Zheng, J., Edge, R., Dallos, P. Isolation of cochlear inner hair cells. Hearing Res. 145, 156-160 (2000).
- Tang, J., Pecka, J. L., Tan, X., Beisel, K. W., He, D. Z. Z. Engineered Pendrin Protein, an Anion Transporter and Molecular Motor. J Biological Chem. 286, 31014-31021 (2011).
- Fu, M., et al. The Effects of Urethane on Rat Outer Hair Cells. Neural Plast. 2016, 1-11 (2016).
