Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Lucas Moritz Wiggenhauser; Katharina Kohl; Nadine Dietrich; Hans-Peter Hammes; Jens Kroll

doi:10.3791/56674

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医学

Estudiar la Diabetes a través de los ojos de un pez: Microdissection, visualización y análisis de la vasculatura de retina de pez cebra de adulto tg(fli:EGFP)

Published: December 26, 2017

doi:

10.3791/56674

Lucas Moritz Wiggenhauser¹, Katharina Kohl², Nadine Dietrich², Hans-Peter Hammes², Jens Kroll¹

¹Department of Vascular Biology and Tumorangiogenesis, Center for Biomedicine and Medical Technology Mannheim (CBTM), Medical Faculty Mannheim,Heidelberg University, ²V. Medical Clinic, Medical Faculty Mannheim,Heidelberg University

Summary

Aquí, discutimos un protocolo de método que permita un fácil análisis de la vasculatura retiniana del pez cebra adulto tg(fli:EGFP) como una lectura rápida en entornos de patologías vasculares a largo plazo vinculados a la neoangiogénesis y cambios estructurales.

Abstract

La retinopatía diabética es la principal causa de ceguera entre adultos de mediana edad. La creciente prevalencia de diabetes en todo el mundo hará la prevención de complicaciones microvasculares de la diabetes uno de los campos de investigación clave de las próximas décadas. Terapia especializada, específica y nuevos medicamentos son necesarios para gestionar el creciente número de pacientes con riesgo de pérdida de la visión. El pez cebra es un animal modelo establecido para las preguntas de investigación del desarrollo con el aumento de relevancia para el modelado de procesos de enfermedad metabólica multifactorial. Las ventajas de las especies permiten una visualización óptima y enfoques, combinados con la fuerte capacidad de noquear a genes de interés de la detección de drogas de alto rendimiento. Aquí, describimos un protocolo que permita la fácil análisis de la vasculatura retiniana del pez cebra adulto tg(fli:EGFP) como una lectura rápida en entornos de patologías vasculares a largo plazo vinculados a la neoangiogénesis, daños a la embarcación. Esto se logra a través de la disección de la retina de pez cebra y montaje de la totalidad del tejido. Visualización de los vasos expuestos se obtiene entonces mediante microscopia confocal de la reportera EGFP verde expresada en la vasculatura retiniana adultos. Manejo correcto del tejido llevará a mejores resultados y menos rotura de vasos internos para asegurar la visualización de la estructura vascular inalterada. El método puede ser utilizado en modelos de pez cebra de la vasculopatía retiniana ligado a cambios en la arquitectura del buque así como la neoangiogénesis.

Introduction

La diabetes mellitus es una enfermedad metabólica definida por hiperglucemia, resultante de la secreción de insulina disfuncional o tejido inadecuada respuesta a la insulina secretada. La OMS estima que vivían 422 millones de adultos con diabetes mellitus en 2014¹ y la prevalencia de diabetes en todo el mundo se espera aumentar a 8-10% de la población hasta 2035², diabetes uno de los campos de investigación clave en el próximas décadas. Vivir con la hiperglucemia crónica conduce a complicaciones microvasculares a largo plazo, incluyendo polineuropatía, la nefropatía y la retinopatía diabética. La gestión y prevención de estas complicaciones son difíciles; de hecho, la diabetes se está convirtiendo en la causa más frecuente de enfermedad renal de fase final (ESRD), que conduce a diálisis², y la diabetes es la principal causa de ceguera entre adultos de mediana edad³.

Las causas iniciales del daño microvascular en la retinopatía diabética están la hiperglucemia crónica, alteraciones metabólicas, así como ciertos factores de riesgo (p. ej., hipertensión, dislipidemia), conduce a la disfunción endotelial vascular, pericyte deserción, y regresión capilar que resulta en mangas vasculares acelulares. La resultante de la isquemia retiniana es la causa de la neovascularización y aumento de la permeabilidad vascular promoviendo el desarrollo de la retinopatía diabética proliferativa (PDR)⁴. La retinopatía diabética generalmente se detectó en 37% de los pacientes con diabetes, mientras que avistar-que amenaza la retinopatía diabética fue comprobada en el 12% de la cohorte Europea blanca seleccionado en el estudio UKADS⁵. El tratamiento actual sólo puede prevenir otras complicaciones y no es capaz de restaurar completamente los daños ya inducido. Photocoagulation del panretinal, además de control de la glucemia, es la terapia estándar para la retinopatía diabética proliferativa (PDR) pero afecta a los tejidos sanos adyacentes también. Intervenciones anti-VEGF muestran resultados prometedores como alternativas al tratamiento de láser⁶^,⁷, pero en última instancia, terapia especializada, dirigida y nuevos medicamentos son necesarios para gestionar el creciente número de pacientes con riesgo de pérdida de la visión.

Los modelos establecidos de investigación animal de la retinopatía diabética no comparten todos los aspectos de Fisiopatología humana. Utilización de la especie correcta para abordar las necesidades específicas de la cuestión de la investigación científica es una de las partes más importantes de la instalación experimental. El embrión de pez cebra (Danio rerio) es ya ampliamente utilizado en la investigación del desarrollo y proporciona un fondo práctico óptimo a genes específicos de precipitación o knockout morfolinos o el CRISPR/Cas9 técnica⁸. Estos métodos pueden ser utilizados fácilmente en pez cebra para investigar los genes, que fueron identificados por estudios de asociación del genoma a gran escala (GWAS), generando ideas en particular mecanismos de progresión de la enfermedad y susceptibilidad⁹. Corto tiempo generacional, grandes cantidades de crías, fácil y bajo costo manejo y cultivo de apoyo de análisis han aumentado la relevancia del modelo de pez cebra, especialmente teniendo en cuenta su gran potencial para el modelado de enfermedad metabólica. Conservación de los mecanismos biológicos en el pez cebra se ha mostrado como una base para el desarrollo de la terapia farmacológica. Por ejemplo, el antidiabético metformina y bajar el colesterol simvastatina han demostrado para “tratar” las condiciones en los modelos de campo/dexametasona-inducida alta PEPCK expresión y colesterol hipercolesterolemia inducida por dieta¹⁰ ^, ¹¹ ^, ¹². esta penetración avanza en general conservados mecanismos metabólicos es apoyada por el creciente número de modelos de diabetes de pez cebra, mediante experimentos tales como: alternando incubación en soluciones de glucosa, Inducida ablación de las células beta, células beta mediada por nitroreductase con el metronidazol prodrug, mediada a través de la caída en gen pdx1 o nocaut, así como modelos de resistencia creciente de la insulina en músculo esquelético de la diabetes monogénica ¹². estos ya establecieron los protocolos, las características mencionadas de la especie, y la habilidad de manipular eficientemente el genoma en un gran número de muestras todos demuestran las ventajas del pez cebra para el estudio de los mecanismos conducir procesos de enfermedad compleja, así como la capacidad para detectar intervenciones farmacológicas.

Una comprensión general de la anatomía de ojo de pez cebra básicos (figura 1) es necesaria para el disector para utilizar el pez cebra como modelo de Angiopatía retiniana. El ojo de pez cebra tiene seis músculos extraoculares, cuatro rectos y dos músculos oblicuos que inserten en el exterior del globo en la esclera¹³. La córnea es el tejido transparente que cubre el lente y sigue directamente en la esclerótica, que forma la capa exterior del ojo. La esclerótica no es transparente, tiene una superficie que refleja parcialmente la luz y es fuertemente pigmentada. La lente sí mismo está más en forma de bola que la contraparte humana. La retina consta de tres capas nucleares de las células neuronales, mientras que la vasculatura retiniana proporcionando oxígeno está estrechamente relacionada con la capa de células ganglionares interno pero no forma una red subretinal. Los vasos coroides, en cambio, se encuentran entre la esclerótica y la retina y están asociados con el epitelio pigmentado retiniano (RPE). Esta red suministra oxígeno a las partes exteriores de la retina¹⁴.

Figura 1: representación esquemática del ojo de pez cebra adulto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Visualización directa de la vasculatura retiniana se logra por la utilización del pez cebra transgénico tg(fli:EGFP) línea¹⁵. La proteína verde fluorescente, expresada bajo el control del fli promotor en células endoteliales de la vasculatura es la base para la visualización mediante un microscopio en los pasos posteriores de escaneo láser. Esto se logra a través de la disección de la retina de pez cebra y montaje de la totalidad del tejido. Este modelo transgénico proporciona una lectura rápida vascular sin ninguna aplicación de etiquetado intravascular o immunohistochemistry del montaje en conjunto. Para analizar la retinopatía diabética en el pez cebra, se recomienda una rutina de preparación paso a paso y estandarizada por cada disector.El siguiente protocolo de preparación permite a otros grupos de investigación para evaluar fácilmente los cambios vasculares en los vasos expuestos del ojo del pez cebra adulto y proporcionar orientación para establecer una rutina de disección optimizado para la retina de pez cebra.

Protocol

Todos los procedimientos, incluyendo medidas relacionadas con temas de animales, han sido aprobados por el Comité de ética de los animales (competente Karlsruhe) y siguen las pautas de cuidado de los animales de la Universidad de Heidelberg. 1. preparación de fijador (PFA 4% / PBS) Preparar fijador fresco cada día para asegurar la conservación óptima de la integridad histológica del tejido. Disolver 0,2 g de hidróxido de sodio (NaOH) en 90 mL de agua destilada doble (ddH2O) agitando constantemente a temperatura ambiente. Añadir paraformaldehido (PFA) de 4 g y revolver hasta que la solución está totalmente clara para al menos 5-10 minutos asegurar la despolimerización de macromoléculas.PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico, manéjela con cuidado. 0,84 g de fosfato dihidrógeno de sodio (NaH2PO4) se disuelven en la solución y control de pH a 7.2 a través de la medición. Ajustar el volumen a 100 mL con ddH2O y filtrar la solución a través de papel de filtro grado 3. Almacenar 4% PFA/PBS en el hielo. 2. preparación de la solución de la eutanasia Nota: Los siguientes pasos se realizaron con la cepa de tipo salvaje pez cebra ABTL en general edad de 6-8 mon. Utilice sulfonato de metano etílico 3-aminobenzoato, también llamado “tricaine” o MS-222, en una concentración de 0,31 mg/mL para el pez cebra eutanasia16. Utilizar 1 x huevo de agua, utilizado para crear embriones de pez cebra, como solvente para la solución de la eutanasia. En general, controlar la profundidad de la anestesia correcta antes de trabajar con peces sedada demostrando la pérdida de equilibrio y tacto pérdida de reacción. Para la realización de 1.000 mL de 10 x huevo de agua, añadir estas sales a 1.000 mL de agua destilada doble (ddH2O) agitando constantemente en el siguiente orden: 10 g de NaCl, 0,3 g de KCl, 0,4 g CaCl2 *6 H2O, 1,32 g de MgSO4 *6 H2O. 3. fijación del tejido de pez cebra Transferencia de solución de PBS/PFA de 4% 6 mL por muestra en los pocillos de placas de 6 pocillos con antelación. Eutanasia el pez cebra adulto (previamente mantenido en un día de luz ciclo estándar, p. ej., 12 h 12 h) 2 h después de luces encender en la mañana, colocándolos en la solución de Metanosulfonato y esperan hasta que han llegado a eutanasia. Después de la cesación del movimiento opercular, que puede tardar hasta 10 minutos. Tomar el pescado fuera de la solución de la eutanasia de Metanosulfonato y ponga sobre toallas de papel fresco. El pescado seco y utilice un bisturí para cortar las cabezas detrás del opérculo (ver figura 2A). Transferir las cabezas directamente en las placas bien preparadas, que contienen el fijador recién preparado. Tienda las placas así que contiene las cabezas de pescado a 4 ° C durante la noche por al menos 24 h asegurar el fijador penetra las capas más profundas de la retinales.Nota: Cabezas de pez cebra pueden almacenarse durante un máximo de 48 horas en el 1 x de tampón fosfato salino (PBS) a 4 ° C antes de la preparación sin una correspondiente pérdida de intensidad de la señal de fluorescencia. Latencia mayor puede conducir a la pérdida de la integridad del tejido y reduce la calidad de imagen y así debe ser evitado. 4. preparación de la vasculatura de la retina de pez cebra Llenar un plato de petri hasta un tercio con agarosa 2% climatizada y espere hasta que el agar es firme. Cubrir la placa de agar con 1 x PBS para crear un espacio de trabajo para diseccionar los ojos.Nota: Esto permitirá que ambos preservación de preparación pinzas y baja presión en el tejido mientras se disecan, reduciendo la probabilidad de daño estructural. Deben realizarse todos los pasos de preparación adicionales en esta área de trabajo utilizando #5 recta Pinzas con puntas finas con un microscopio de disección con epi-iluminación adicional. Mientras de disección, utilizar magnificación entre 4.0 y 6.0 x para permitir la descripción y evaluación de atención a los detalles del tejido. Transferir la muestra fija en la caja Petri y, manteniendo la cabeza en la superficie del corte con una pinza, colocar otra pinza cubrió juntos debajo del globo ocular en la cavidad orbital. Lentamente abra la pinza debajo del ojo y agarre el nervio óptico, entonces con cuidado rasgue y separar los ojos (figura 2B). Figura 2: remoción del ojo de pez cebra adulto. Vista córnea con el ojo en la cavidad orbitaria y del nervio óptico intacto (A). Vista corneal con el ojo independiente (B). Representación esquemática del ojo de pez cebra en este paso (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Eliminar cualquiera de los cuatro rectos y dos oblicuos los músculos extraoculares que todavía están conectados a los ojos como residual tejido extraocular conectarse el ojo de la cavidad orbital (Comparar figura 3 y figura 4). Ello por sostener detrás el ojo a través de un medio cerrado de pinzas y suavemente la estructura con la otra pinza de agarre, rasgar con un movimiento diametral. Puesto que agarre directamente el globo ocular conduce a la rotura de vasos internos, esta técnica es apropiadamente suave para preservar la vasculatura. Figura 3: ojo de pez cebra adulto con los músculos extraoculares en foco. Vista lateral con fijación de un músculo extraocular al borde exterior izquierdo del globo ocular en foco (A). Vista de lateral del nervio óptico con músculos extraoculares simétricamente flanqueando el nervio óptico (B). Representación esquemática del ojo de pez cebra en este paso (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Usar una aguja desechable 27G (0.4 x 19 mm) para perforar la córnea (figura 4, flecha roja) en el tiro exterior. A través de esta abertura mantenga la córnea con ambas pinzas y abra un poco. Luego trabajan cuidadosamente para crear una lágrima centrada aproximadamente el tamaño de la pupila respectivo. Figura 4: ojo de pez cebra adulto después del retiro de todos los músculos extraoculares. Vista lateral con el borde externo autorizado del ocular globo visible (A).Vista de lateral del nervio óptico con nervio óptico en el centro. La esclerótica que reflejen la luz no cubre toda el área alrededor del nervio (línea discontinua roja) (B). Representación esquemática del ojo de pez cebra en este paso (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Aplique presión en el lado de la córnea del globo ocular (bulbus oculi) en el borde externo de la córneo sobre el iris. Esto creará una pequeña abolladura y empuje la lente a la altura de la rotura corneal. Ejecutar la pinza debajo de la lente y extraerlo (figura 5A). Figura 5: ojo de pez cebra adulto en el proceso de extracción del lente. Vista lateral córnea con la lente impulsó la lágrima córnea (A). Vista córnea con la lente al lado del globo ocular (B). Representación esquemática del ojo de pez cebra en este paso (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Girar el ojo hacia abajo para el nervio óptico hacia el investigador. Tenga en cuenta que la esclerótica y la córnea están conectados y forman la túnica fibrosa del bulbo ocular para proteger a la retina en forma de copa. (Figura 6). Esta cáscara, que consiste en la córnea y la esclera, también se llama “corneosclera” y repuestos el área alrededor del nervio óptico (Figura 4B, línea discontinua roja). Insertar una aguja en esta interrupción una vez para crear una abertura entre la esclerótica y la retina. Figura 6: Corneosclera de la esclerótica y la córnea, que está desconectado del resto tejido intraocular. Vista de córnea lateral que muestra la continuación de la córnea transparente en la esclerótica pigmentada (A). Vista lateral centrado en la parte escleral de la corneosclera (B). Representación esquemática de la corneosclera eliminado (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Mediante este acceso con ambas pinzas, cuidadosamente rasgar la esclera axialmente en bandas para aumentar la abertura alrededor del nervio óptico. Tenga cuidado de mantener el corneosclera intacto en la transición a la circunferencia de la córnea lateral (ver figura 6A). Mantenga la esclerótica con una pinza y, agarrando el nervio óptico con el otro y tirando, retire el corneosclera del ojo completamente y descartarlo (figura 6). Tratar de cortar las conexiones antes de separar el corneosclera y el restante tejido intraocular, como adjunto a otras estructuras será un punto crítico; Este paso le proporcionará una estructura en forma de Copa formada por la úvea y la retina que contiene la vasculatura retiniana (figura 7). Crear una ruptura de la capa coroides/RPE manteniendo una aguja de 27G lateralmente a la taza restante mientras que raspar la superficie con el borde de la punta de la aguja. Utilizar la ruptura como un punto de acceso para conseguir un apretón en la capa de la coroides/RPE y rip con dos pinzas a rayas, pero mantener la conexión con el diafragma intacto. Luego, ejecute una pinza bajo el diafragma y dar la vuelta en un circuito desde el exterior creando tensión tirando de la capa coroides/RPE discontinuada para lograr la separación de la estructura combinada.Nota: El iris debe ser desconectado, con el fin de no obstruir la fluorescencia al visualizar los vasos (figura 8B). Agarrando el iris directamente para quitarlo puede llevar a dañar los vasos extensa, especialmente en el círculo interno de óptico (COI), ya que el iris todavía está conectado al tejido circundante. La capa de la coroides y el epitelio pigmentado retiniano (RPE) pueden ser separados y a menudo conservan una conexión con el diafragma, que permite una fácil extracción secundaria. Si no puede quitar partes del iris, utilizar un punto de ruptura natural que el ojo del pez cebra adulto exhibe dentro de la capa de fotorreceptores (PL), de manera similar al paso 4.9, para remover el diafragma. Raspar sobre el exterior de la retina en forma de taza restante para inducir interrupciones en el PL por encima del punto de ruptura (figura 11, flecha negra). Utilice el acceso creado para quitar la parte superior de la capa mientras mantiene intacta la conexión posible con el diafragma. Luego, ejecutar las pinzas debajo del diafragma y recorrer en un circuito, como se mencionó anteriormente para separar la estructura combinada.Nota: Uno debe ejercer paciencia el paso entero 4.9 puede ser difícil, pero esta atención lograrán un mejor resultado vascular que directamente agarrar el iris en el borde de la pupila o forzando una abertura por la destrucción de las conexiones a la coroides/RPE o capa de fotorreceptores sin su respectiva eliminación. Después de este paso así preservar la integridad vascular retiniana, pero conducir al daño de las capas externas de la retinales. Figura 7: ojo de pez cebra adulto después del retiro de la corneosclera. La vista lateral muestra el tejido intraocular restante con intacto del iris y del nervio óptico (A). Vista de la córnea lateral con iris en foco (B). Representación esquemática del ojo de pez cebra en este paso (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Utilizar una tijera de primavera de microdisección con un filo recto 2,5 mm para cortar el nervio óptico lo más cerca posible de la retina; Esto permitirá un mejor montaje de planos del tejido. Figura 8: ojo de pez cebra adulto después del retiro del EPR/coroides y nervio óptico truncado. Vista del lateral del nervio óptico muestra la retina con un truncado del nervio óptico (A). Vista de la córnea lateral con una mirada directa a la capa más interna de la retina (B). Representación esquemática del ojo de pez cebra en este paso (C).Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 5. montaje de la vasculatura retiniana Lave la retina disecada dos veces durante 5 minutos en PBS 1 x. Para transferir la retina después de truncamiento del nervio óptico, utilizar una espátula de laboratorio con un extremo de la cuchara micro para evitar la manipulación directa de los tejidos expuestos. Coloque una gota de PBS sobre un portaobjetos de vidrio y transferir la retina a la gota. Utilizar una pinza para mantener el tejido en su lugar mientras se reduce a la estructura en forma de copa con un escalpelo para crear una forma plana pétalos de cuatro o cinco pétalos dependiendo del tamaño de la retina (ver figura 9). Aspirar el PBS sobrante con un pedazo fino de papel. Tenga cuidado de no tocar la retina. Capa de la retina plana montada en medios de montaje y cubrir con un cubreobjetos. Estar atentos no a crear espuma, como las burbujas de aire pueden distorsionar la visualización de los vasos retinianos. Minimizar el movimiento del cubreobjetos y sellar la cubierta con esmalte de uñas claro. 6. visualización de la vasculatura retiniana Mantener la diferencia de tiempo entre preparación y visualización lo más corto posible reducir la pérdida de detalle de imagen a través de la pérdida de la señal de fluorescencia. Almacenar los soportes de la vasculatura retiniana preparados a 4 ° C para reducir la pérdida de señal, si no se logra la visualización directa, como degradación de la calidad de la imagen poco a poco se convierte en visible 48 h después de la preparación. Visualizar los soportes de la vasculatura retiniana mediante microscopía de fluorescencia o microscopía confocal con láser.Nota: Visualización de vasos por microscopía de fluorescencia se logró con 2,5 aumentos con un tiempo de exposición de 2,0 s, aumento de 6,0 x y gamma configuración de 1.67. Para microscopía confocal, se utilizó un láser de Ar (488 nm/20 mW) en el 20% de potencia en combinación con un filtro de excitación de TD 488/543/633, un 20 x / 0.7 objetivo de multi-inmersión NA con ddH2O como medios de inmersión y ajustes del filtro de emisiones de 505-560 nm. Fotos confocales se componen de 4 x 4, 4 x 5 o 5 x 5 imágenes singulares combinados a través de una exploración azulejo dependiendo del tamaño retiniano. 7. le las secciones de la Retina de pez cebra Nota: Para secciones de de la retina de pez cebra, preparar el tejido como se describe en el protocolo hasta el paso 4.5 y luego vaya directamente al paso 7.1. Lavar los ojos enucleated (tras el paso 4.5) dos veces durante 5 minutos en PBS 1 x. Luego, transferir el tejido a 70% de etanol (EtOH). En este punto, ojos preparados pueden conservarse a 4 ° C hasta la inclusión en parafina. Lavar el tejido de la siguiente manera para deshidratar antes de inclusión en parafina: 2 x 15 min en etanol al 80%, 2 x 15 min en etanol al 90%, 3 x 15 min en etanol de 96%, 3 x 15 minutos en etanol al 99%, 2 x 15 min en acetone/99% etanol (1:2), 3 x 15 min en acetona. Mantener el tejido en parafina a 62 ° C durante la noche. Calentar parafina fresca a 62 ° C y verter en moldes de inclusión. Transferir el tejido en los moldes directamente y, en un ritmo rápido, control de la orientación correcta de los ojos para la sección deseada. Luego, aplicar un cassette inclusión al molde y cubrir con parafina caliente adicional. Retire los moldes de inclusión después de bloques de parafina se hayan enfriado. Cortar los bloques de parafina en un micrótomo en 10 secciones de μm y flotar hacia fuera en un baño de agua de 45 ° C en la superficie del agua el tiempo suficiente para que aplane completamente. Tomar las secciones en un portaobjetos de vidrio y escurrir verticalmente para quitar exceso de agua antes de secarlas durante la noche en una estufa a 45 ° C. Proceso de las secciones más con el siguiente calendario para Desparafinizar y mancha: 4 x 1 min en xilol, 1 x 1 minuto en etanol al 99%, 1 x 1 minuto en etanol al 96%, 1 x 1 minuto en etanol al 80%, 1 x 1 minuto en etanol al 70%, 1 x 1 min en ddH2O, 1 x 4 minutos en hematoxilina de Mayer , 1 x 10 min en ddH2O, 1x2min en eosina 0,5%, 1 x 30 s en ddH2O, 1 x 30 s en etanol al 80%, 2 x 30 s en etanol 96%, 3 x 1 minuto en etanol al 99% y 1 x 1 min en xilol. Toma el portaobjetos de cristal en el xilol y cubrir rápidamente el tejido con el montaje de los medios de comunicación. Evitar para dejar el tejido seque completamente, luego coloque un cubreobjetos encima y sellar el tejido manchado.

Representative Results

Aquí muestran dos ejemplos morfológicos típicos de la vasculatura retiniana en el pez cebra adulto tg(fli:EGFP): una vez visualizado con el microscopio de fluorescencia (Figura 9A) y una vez con un láser confocal de barrido microscopio (figura 9B). La estructura retiniana revelada muestra un patrón altamente organizado. Autofluorescencia fuerte se ve en la retina de pez cebra, cuando es visualizado con el microscopio de fluorescencia. Así, se recomienda una visualización de sólo la capa vascular a través de una exploración confocal para reducir la fluorescencia del fondo y aumentar el contraste. Para la más rápida adquisición de la imagen o situaciones donde los datos cualitativos son bastantes, el microscopio de fluorescencia es una alternativa atractiva. Figura 9: cuadros representativos de la vasculatura retiniana de pez cebra adulto tg(fli:EGFP). Se muestran dos ejemplos morfológicos típicos de la vasculatura retiniana: la arteria central de la óptica se separa en 5-7 principales vasos, que luego se ramifican en una sucesión de arcadas. Todos los buques más drenan en la vena periférica (CV) limita la parte exterior de cada pétalo. Visualización mediante microscopía de fluorescencia en 2.5 x de aumento (A). Visualización de la vasculatura retiniana por láser confocal de barrido microscopía a través de un análisis combinado de azulejo imagen de 5 x 5 (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. La arteria óptica penetra la retina en la papila óptica y, en la mayoría de las muestras, se separa en 5-7 vasos principales (figura 10A). Los vasos principales entonces rama en una sucesión de arcadas y conecta al óptico círculo interno (COI), también llamado la vena periférica (CV), rodea el disco óptico en la periferia de la retina montada plana (ver figura 10B). El COI es el vaso venoso que drena la sangre arterial en el borde interno del globo ocular (bulbus oculi). La vasculatura retiniana de pez cebra también muestra las áreas de alta actividad vascular con ramificación de los capilares y angiogénicos brotación (figura 10). Esta actividad vascular se encuentra principalmente en proximidad cercana al COI. Es importante hacer notar que el mismo ojo puede demostrar ambas actividades y vasculares en diferentes regiones de la retina (Comparar figura 10B y figura 10). En general, la vasculatura retiniana del pez cebra muestra más espacio avascular y menos capilares entre las ramas principales con respecto a, por ejemplo, la retina de ratones17. Ambos ojos de cada muestra deben ser analizadas ya la vasculatura puede variar entre inspección singular puede dar lugar a sesgo. Figura 10: amplifica las zonas de visualización de la vasculatura retiniana pez cebra adulto tg(fli:EGFP). La arteria óptica ramificación en los vasos principales (A). Capilares de la retina en una zona de baja actividad vascular conexión al círculo interno de óptico (COI) en la parte inferior de la imagen (B). Capilares de la retina en una zona de alta actividad vascular que conecta a la IOC (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Una arquitectura altamente conservadas de capas neuronales ya está presente en el pez cebra de aproximadamente 72 h post fertilización (hpf),18. La retina de pez cebra adulto muestra las siguientes capas de adentro hacia afuera (figura 11): capa de células ganglionares (GCL), la capa plexiforme interna (IPL), la capa nuclear interna (INL), la capa plexiforme externa (OPL), capa nuclear externa (ONL), capa de fotorreceptores (PL), y el epitelio pigmentado retiniano (RPE). La estimación de los parámetros de visualización de la vasculatura retiniana vasculares se muestra en la figura 12. La vasculatura retiniana interna está situada en la capa de células ganglionares (GCL) (figura 13B, caja blanca) mientras la coroides capilares estaría asociados con el epitelio pigmentado retiniano (RPE). Figura 11: la coloración del pez cebra adulto ojo. Resumen transversal del ojo entero después del retiro de la lente (A). Capas de retinales de pez cebra adulto ojo19 (B). Indicación (flecha negra) del natural punto de ruptura en la PL (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Modelos de neoangiogénesis retiniana inducida por hipoxia muestran aumento en el número de puntos de ramificación, angiogénica brotes, total área vascular y disminución de distancia intercapillary en pez cebra²⁰. Estos resultados apoyan la idea de que el pez cebra es susceptible a las complicaciones microvasculares diabéticas²¹, como resultados de después de la retinopatía diabética incluyen neoangiogenesis mediada por la hipoxia, que está fuertemente vinculada a la expresión de VEGF. Cambios inducidos por la hiperglucemia en la retina de pez cebra conducen a mayor espesor de los vasos pero mantienen la general dibujo²². También alternando la inmersión en soluciones glucosadas durante 30 días disminuye el espesor de la IPL y INL²³. También ya fue demostrada la influencia directa de los metabolitos de la glucosa en el pez cebra como metabólicos autores de vasculopathy. Hyperbranching vascular adicional se observó en la vasculatura de tronco de embriones de pez cebra tras la incubación con metilglioxal²⁴. Actualmente, existe un modelo animal que proporciona todos los criterios claves de la retinopatía diabética. Cambios tempranos se encuentran a menudo, pero la progresión a retinopatía diabética proliferativa falta²⁵. El pez cebra también cae en esta definición, como hemos visto sólo neoangiogenesis mediada por la hipoxia o los cambios inducidos por la hiperglucemia hasta ahora. Los resultados actuales apoyan la idea de que el pez cebra es susceptible a cambios vasculares mediada por hiperglucemia y como modelo animal potencialmente puede mostrar una progresión a retinopatía diabética proliferativa. Dependiendo de la fuerza y la exposición al efecto mediado por la hiperglucemia, el modelo experimental derecha podría conducir a isquemia en ciertas áreas de la retina de pez cebra y promover neoangiogenesis como los principales criterios de la retinopatía diabética proliferativa. Sin embargo, como el pez cebra es comparable nuevo jugador en el campo de la modelización a largo plazo patologías microvasculares, modelos próximos de la diabetes en el pez cebra proporcionar información adicional y aclarar su importancia con respecto a otros modelos y sus patologías. Por ejemplo, una cruz de pez cebra tg(gata1a:DsRed) con eritrocitos con etiqueta roja en la línea de tg(fli:EGFP) podría utilizarse simultáneamente visualizar potenciales intraoculares bleedings en el futuro modelos de pez cebra con microaneurismas como predictor de progresión a RDP.

Puesto que la vasculatura retiniana progresa en una sucesión de arcadas, evaluación de la distancia de Punteaduras, número de puntos de ramificación y el área vascular total se relaciona con la distancia de la arteria central de la óptica. Para evitar sesgos en los parámetros vasculares evaluados, se requiere un punto de orientación. El COI es una estructura y es muy relevante puesto que las áreas de la actividad vascular mienten en la proximidad espacial directa. Para la evaluación constante, la exploración retiniana se debe dividir en varias secciones de la imagen rectangular con una distancia coherente al COI. Debe analizarse la retina entera e imágenes numéricamente simétricamente distribución. La retina de pez cebra muestra áreas con densidad alta y baja capilar y una distribución desigual de las secciones de la imagen puede dar lugar a sesgo adicional.

Figura 12: presentación de ejemplo de parámetros vasculares como lectura de visualización de la vasculatura retiniana. Medición de distancia Punteaduras (doble flecha roja) cerca de la óptica interior del círculo (IOC) (A). Tres puntos de ramificación (círculos rojos) cerca de la IOC (B). Visualización de la vasculatura retiniana de pez cebra con un área ampliada (cuadro rojo) mostrando un vaso despunte (C). Diámetro del vaso medido sobre una cierta distancia (doble flecha blanca) de la arteria central (cruz blanca) (D). Densidad del barco es el porcentaje de área retiniana ocupada por superposición de vasos (líneas rojas diagonales) (E). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para medir la distancia de Punteaduras, es necesario establecer una cierta distancia al COI como estándar (figura 12A, doble flecha blanca) y dibujar una línea horizontal imaginaria (figura 12A, línea blanca horizontal) paralelo al COI. La distancia entre los buques de esta línea suma y promedio aritmético es igual a la distancia de Punteaduras. Puntos de ramificación son contados dentro de cada imagen, cada vez que un buque parte y continuar con más de un lumen vascular desde el punto de origen. Esto también incluye conexiones horizontales entre capilares. Es importante permanecer consistente con el análisis y decidir qué puntos de ramificación para contar y mantener estas reglas durante todo el experimento entero para reducir la variación innecesaria. Brotes vasculares, como se muestra en la figura 12, es otro parámetro que puede ser contado en cada imagen para evaluar la influencia en la vasculatura retiniana. Brotes angiogénicos no siguen la sucesión de arcade-como entre arteria central y COI y foco cerca de la parte externa de la retina. Para evaluar determinados diámetros de vaso, un punto de orientación es siempre necesario que una distancia fija marca la medición spot. Origen de la arteria central dentro de la retina proporciona dicha orientación para los vasos del tallo principal (figura 12D, blanca Cruz). El área ocupada por los vasos (figura 12E, líneas diagonales rojas) como un porcentaje del área entera retiniano es la densidad vascular e indirectamente se corresponde con la zona avascular.

Una completa exploración confocal de una muestra debe estar compuesto por varias imágenes de alto detalle para permitir una visualización de pequeñas hypersprouting capilar. Para optimizar tiempo y recursos gastados en este paso, puede usarse un procedimiento automatizado de labranza con una profundidad de exploración general para cada azulejo. Montaje de la retina puede aumentar considerablemente el tiempo empleado para la exploración de la vasculatura con un microscopio confocal. En un enfoque óptimo uno quisiera sólo escanear la capa vascular (figura 13B, caja blanca), pero la inclusión parcial de la GCL es a menudo necesario.Dejando un exceso de longitud del nervio óptico después de truncamiento, así como los cortes para lograr el montaje plano siendo demasiado corto, puede llevar a montaje.

Figura 13: comparación de la coloración y autofluorescencia en la retina de pez cebra adulto. Vasculatura retiniana en foco por encima de la GCL (A). Vasculatura retiniana (caja blanca) mostrando verde una señal EGFP y capas retinianas exhibiendo fuerte autofluorescencia (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Como la preparación adecuada de la vasculatura retiniana del pez cebra necesita formación previa, una muestra de tamaño pequeño con disectores no entrenadas y fuertemente que varía los resultados de preparación son una limitación principal de la técnica. Mientras que la preparación de ojos de pez cebra de tg(fli:EGFP) da una visión rápida del estado de la vasculatura, la técnica utiliza todavía alrededor de 20 minutos de tiempo de trabajo por la retina para un investigador experimentado. Todos estos pasos de preparación de la vasculatura retiniana deben realizarse con un microscopio de disección y disectores necesidad de mantenerse concentrado todo el tiempo como un paso descuidado potencialmente puede inducir la rotura del recipiente. El disector debe practicar regularmente como ausencia prolongado de preparación reduce la probabilidad de un disector de mantener la integridad del buque.

Además, lectura adicional mediante inmunohistoquímica (IHQ) es aún limitado, como sólo un pequeño número de anticuerpos validado en tejido humano y roedor está trabajando con el pez cebra. Experimentadores de IHC se recomienda buscar anticuerpos específicos de pez cebra, especialmente cuando se trabaja con nuevos objetivos. Como alternativa, se recomienda utilizar líneas de reportero de pez cebra adicionales que son útiles para el estudio de células más allá de la vasculatura en el ojo. Esta estrategia, sin embargo, es lento, que tarda unos meses para generar líneas de pez cebra adulto que llevan varios reporteros transgénicos.

Sin embargo, el pez cebra presenta una gama única de ventajas. Son relativamente pequeños y reproducir fácilmente. Pueden crecer rápidamente a etapas adultas y sus embriones son óptimas para la detección de drogas. El campo está creciendo rápidamente y más literatura resulta accesible. Con la capacidad para generar nocauts del gene en una velocidad rápida y una abundancia de líneas de reportero de fluorescencia de transgenes, la elección de pez cebra sólo es refrenada por la pregunta de investigación solicitadas.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer a Katrin Bennewitz y Marlene Hausner cría de pez cebra y asistencia técnica. Los autores reconocen el apoyo de la base centro vivo celular imágenes Mannheim en el centro de Biomedicina y Mannheim de tecnología médica (DFG INST 91027/9-1). Este estudio fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (internacional investigación formación grupo 1874/1 “DIAMICOM”, proyecto SP5 y SP9; SFB1118 de centro de investigación colaborativo, proyecto B1 y proyecto de investigación colaborativo centro SFB/TR23 Z5).

Materials

NaOH	Roth	6771.3
KCl	Merck	1.04936
CaCl_2*6H₂0	Roth	5239.2
MgSO_4*7H₂0	Merck	1.05886.0500
Paraformaldehyd	Roth	0335.3
Sodium dihydrogen phosphate	Roth	2370.1
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (MS-222,Tricaine)	Sigma	A5040
PBS	Roth	9143.1
Agarose	Roth	2267.3
Fluoromount-G	Thermo-Fischer	00-4958-02
Petri dish	Greiner Bio one	633180
Six-well plate	StarLab	CC7682-7506
Needle	MSG Praxisbedarf	BD 300900
Micro Tweezer	World Precision Instruments	14095
Microdissection Scissor	World Precision Instruments	501778
Glass slide	Carl Roth	H872.1
Coverslip 22mmx22mm	neoLab	103512222
Scalpel	MSG Praxisbedarf	FEA111
Epi-Illumination	Leica	10446389
Fluorescence stereomicroscope MZ10 F	Leica	NA
Confocal laser-scanning microscope SP5 DS	Leica	NA
Stereomicroscope M80	Leica	NA
Zebrafish line: Tg(fli:EGFP), ABTL wildtype	NA	NA	see Reference 15
Mayer’s hematoxylin	Dr. K. Hollborn & Söhne	0088663
0.5% eosin	Dr. K. Hollborn & Söhne	NA
99,9% ethanol	Roth	9065.2
Paraffin	Merck	1,071,501,000
Xylol	Roth	4436.2
Acetone	Emsure	606-001-00-8
Microtome RM 2165	Leica	NA

References

WHO. . Global report on diabetes. , 88 (2016).
Lim, A. Diabetic nephropathy – complications and treatment. Int J Nephrol Renovasc Dis. 7, 361-381 (2014).
Yau, J. W., et al. Global prevalence and major risk factors of diabetic retinopathy. Diabetes Care. 35 (3), 556-564 (2012).
Cheung, N., Mitchell, P., Wong, T. Y. Diabetic retinopathy. The Lancet. 376 (9735), 124-136 (2010).
Raymond, N. T., et al. Higher prevalence of retinopathy in diabetic patients of South Asian ethnicity compared with white Europeans in the community: a cross-sectional study. Diabetes Care. 32 (3), 410-415 (2009).
Heng, L. Z., et al. Diabetic retinopathy: pathogenesis, clinical grading, management and future developments. Diabet Med. 30 (6), 640-650 (2013).
Writing Committee for the Diabetic Retinopathy Clinical Research, N., et al. Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 314 (20), 2137-2146 (2015).
Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
Sharma, K. R., et al. ELMO1 protects renal structure and ultrafiltration in kidney development and under diabetic conditions. Sci Rep. 6, 37172 (2016).
Baek, J. S., Fang, L., Li, A. C., Miller, Y. I. Ezetimibe and simvastatin reduce cholesterol levels in zebrafish larvae fed a high-cholesterol diet. Cholesterol. , 564705 (2012).
Elo, B., Villano, C. M., Govorko, D., White, L. A. Larval zebrafish as a model for glucose metabolism: expression of phosphoenolpyruvate carboxykinase as a marker for exposure to anti-diabetic compounds. J Mol Endocrinol. 38 (4), 433-440 (2007).
Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. Little Fish, Big Data: Zebrafish as a Model for Cardiovascular and Metabolic Disease. Physiol Rev. 97 (3), 889-938 (2017).
Kasprick, D. S., et al. Microanatomy of adult zebrafish extraocular muscles. PLoS One. 6 (11), e27095 (2011).
Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. The visual system of zebrafish and its use to model human ocular diseases. Dev Neurobiol. 72 (3), 302-327 (2012).
Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).
Bell, B. A., et al. Retinal vasculature of adult zebrafish: in vivo imaging using confocal scanning laser ophthalmoscopy. Exp Eye Res. 129, 107-118 (2014).
Avanesov, A., Malicki, J. Analysis of the retina in the zebrafish model. Methods Cell Biol. 100, 153-204 (2010).
Gramage, E., Li, J., Hitchcock, P. The expression and function of midkine in the vertebrate retina. Br J Pharmacol. 171 (4), 913-923 (2014).
Cao, R., Jensen, L. D., Soll, I., Hauptmann, G., Cao, Y. Hypoxia-induced retinal angiogenesis in zebrafish as a model to study retinopathy. PLoS One. 3 (7), e2748 (2008).
Jorgens, K., Hillebrands, J. L., Hammes, H. P., Kroll, J. Zebrafish: a model for understanding diabetic complications. Exp Clin Endocrinol Diabetes. 120 (4), 186-187 (2012).
Alvarez, Y., et al. Predominant cone photoreceptor dysfunction in a hyperglycaemic model of non-proliferative diabetic retinopathy. Dis Model Mech. 3 (3-4), 236-245 (2010).
Gleeson, M., Connaughton, V., Arneson, L. S. Induction of hyperglycaemia in zebrafish (Danio rerio) leads to morphological changes in the retina. Acta Diabetol. 44 (3), 157-163 (2007).
Jorgens, K., et al. High tissue glucose alters intersomitic blood vessels in zebrafish via methylglyoxal targeting the VEGF receptor signaling cascade. Diabetes. 64 (1), 213-225 (2015).
Lai, A. K., Lo, A. C. Animal models of diabetic retinopathy: summary and comparison. J Diabetes Res. 2013, 106594 (2013).

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Wiggenhauser, L. M., Kohl, K., Dietrich, N., Hammes, H., Kroll, J. Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature. J. Vis. Exp. (130), e56674, doi:10.3791/56674 (2017).