Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Lucas Moritz Wiggenhauser; Katharina Kohl; Nadine Dietrich; Hans-Peter Hammes; Jens Kroll

doi:10.3791/56674

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医学

Estudando a Diabetes através dos olhos de um peixe: Microdissection, visualização e análise do tg(fli:EGFP) adulto vasculatura da retina de Zebrafish

Published: December 26, 2017

doi:

10.3791/56674

Lucas Moritz Wiggenhauser¹, Katharina Kohl², Nadine Dietrich², Hans-Peter Hammes², Jens Kroll¹

¹Department of Vascular Biology and Tumorangiogenesis, Center for Biomedicine and Medical Technology Mannheim (CBTM), Medical Faculty Mannheim,Heidelberg University, ²V. Medical Clinic, Medical Faculty Mannheim,Heidelberg University

Summary

Aqui, vamos discutir um protocolo do método que permite uma análise fácil da vasculatura da retina tg(fli:EGFP) adulto zebrafish como uma leitura rápida em configurações de longo prazo patologias vasculares relacionadas a neoangiogênese e mudanças estruturais.

Abstract

Retinopatia diabética é a principal causa de cegueira entre adultos de meia-idade. A crescente prevalência de diabetes no mundo vai fazer a prevenção de complicações microvasculares diabéticas dentre os campos de pesquisa chave das próximas décadas. Terapia especializada, direcionada e novos medicamentos terapêuticos são necessários para gerenciar o crescente número de pacientes em risco de perda de visão. O peixe-zebra é um modelo animal estabelecido para questões de investigação do desenvolvimento com crescente relevância para a modelagem de processos metabólicos doença multifatorial. As vantagens da espécie permitem visualização ideal e abordagens, combinadas com a capacidade forte para derrubar os genes de interesse de despistagem de drogas de alto rendimento. Aqui, descrevemos um protocolo que permitirá facilitar a análise da vasculatura da retina tg(fli:EGFP) adulto zebrafish como uma leitura rápida nas configurações das patologias vasculares a longo prazo, relacionadas com danos neoangiogênese ou embarcação. Isto é conseguido através de dissecação da retina zebrafish e toda a montagem do tecido. Visualização dos vasos expostos então é conseguida através de microscopia confocal do repórter EGFP verde expressado na vasculatura da retina adulta. Manuseamento correcto do tecido conduzirá a melhores resultados e menos ruptura do vaso interno para garantir a visualização da estrutura vascular inalterada. O método pode ser utilizado em modelos de zebrafish de retina vasculopatia associada a alterações na arquitetura do navio, bem como a neoangiogênese.

Introduction

Diabetes mellitus é uma doença metabólica definida pela hiperglicemia resultante da secreção de insulina disfuncional ou resposta tissular inadequada à insulina secretada. A OMS estima que adultos 422 milhões estavam vivendo com diabetes mellitus em 2014¹ e a prevalência de diabetes no mundo deverá aumentar para 8-10% da população até 2035², tornando se um dos campos de chave de pesquisa em diabetes do próximas décadas. Viver com açúcar elevado no sangue crônico leva a longo prazo complicações microvasculares, incluindo polineuropatia, nefropatia e retinopatia diabética. A gestão e prevenção destas complicações são difíceis; na verdade, o diabetes está se tornando a causa mais frequente de estágio final da doença renal (DRT), que leva à diálise², e diabetes é a principal causa de cegueira entre adultos de meia-idade³.

As causas iniciais de dano microvascular no olho diabético são hiperglicemia crônica, alterações metabólicas, bem como certos fatores de risco (por exemplo, hipertensão arterial, dislipidemia), levando à disfunção endotelial vascular, Pericito desistente, e regressão capilar que resulta em mangas vasculares acelulares. A isquemia resultante da retina é a causa da neovascularização e aumento da permeabilidade vascular, promovendo o desenvolvimento da retinopatia diabética proliferativa (PDR)⁴. Retinopatia diabética geralmente foi detectada em 37% dos pacientes com diabetes, enquanto visão em risco de retinopatia diabética foi verificada em 12% da coorte Europeu branco selecionado no estudo UKADS⁵. O tratamento atual só pode evitar mais complicações e não é capaz de restaurar completamente o dano já induzido. Fotocoagulação Panretinal, além do controle glicêmico, é a terapia padrão para a retinopatia diabética proliferativa (PDR), mas afeta o tecido saudável adjacente também. Intervenções de anti-VEGF mostram resultados promissores como alternativas à laser tratamento⁶^,⁷, mas em última análise, terapia especializada e orientada e novas drogas são necessárias para gerenciar o crescente número de pacientes em risco de perda de visão.

Os modelos de pesquisa animal estabelecidos da retinopatia diabética não partilhar todos os aspectos da fisiopatologia humana. Utilização da espécie correta para atender aos requisitos específicos da questão de investigação científica é uma das partes mais importantes da instalação do experimental. O embrião de peixe-zebra (Danio rerio) é já amplamente utilizado na investigação do desenvolvimento e fornece um fundo prático ideal para genes específicos knockdown ou nocaute via morpholinos ou a técnica CRISPR/Cas9⁸. Esses métodos podem ser utilizados facilmente no zebrafish para investigar os genes, que foram identificados por estudos de associação de todo o genoma de grande escala (GWAS), gerando insights em particulares mecanismos de progressão da doença e susceptibilidade⁹. Curto tempo geracional, grandes quantidades de crias, fácil e manipulação de baixo custo e crescimento do apoio do ensaio aumentaram a relevância do modelo zebrafish, especialmente, dado o seu grande potencial para a modelagem de doenças metabólicas. Conservação dos mecanismos biológicos no zebrafish foi mostrada como uma base para o desenvolvimento da terapia farmacológica. Por exemplo, o medicamento anti-diabético Metformina e colesterol sinvastatina foram mostrados para “tratar” condições em modelos de acampamento/dexametasona-induzido alta PEPCK expressão e colesterol hipercolesterolemia induzida por dieta¹⁰ ^, ¹¹ ^, ¹². este avanço insight abrangente conservados mecanismos metabólicos mais é suportado pelo crescente número de modelos de diabetes zebrafish, através de experiências tais como: alternância de incubação em soluções de glicose, Induzido por estreptozotocina a ablação das células beta, ablação mediada por nitroreductase beta célula usando o metronidazol pró-fármaco, monogénicas diabetes mediada via knockdown de gene pdx1 ou nocaute, bem como modelos de resistência à insulina aumentada em músculo esquelético ¹². estas já estabeleceram protocolos, as especificidades acima mencionados da espécie, e a capacidade de manipular eficientemente o genoma em um grande número de amostras todas demonstrar as vantagens do peixe-zebra para estudar os mecanismos conduzir processos de doenças complexas, bem como a capacidade de tela para intervenções farmacológicas.

Uma compreensão geral da Anatomia básica zebrafish olho (Figura 1) é necessária para o Dissecador para utilizar zebrafish como um modelo para angiopatia da retina. O olho de peixe-zebra tem seis músculos extraoculares, quatro reto e dois músculos oblíquos que inserir na parte externa do globo na esclera¹³. A córnea é o tecido transparente cobrindo a lente e continua diretamente para a esclera, que forma a camada externa do olho. A esclera é opaca, tem uma superfície reflectora parcialmente luz e é fortemente pigmentada. A lente em si é mais bola em forma do que a contraparte humana. A retina consiste de três camadas nucleares de células neuronais enquanto vasculatura da retina cedência de oxigênio está intimamente associada com a camada de células ganglionares interna mas não forma uma rede subretinal. Vasos da coroide, em contraste, deite-se entre a esclera e a retina e estão associados com o epitélio pigmentado da retina (RPE). Esta rede capilar fornece oxigênio para partes exteriores do retina¹⁴.

Figura 1: representação esquemática do olho adulto zebrafish. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Visualização direta da vasculatura da retina pode ser conseguida pela utilização do zebrafish transgênicos tg(fli:EGFP) linha¹⁵. A proteína verde fluorescente, expressada sob controle do promotor fli em células endoteliais da vasculatura é a base para a visualização através de um laser microscópio nas etapas posteriores. Isto é conseguido através de dissecação da retina zebrafish e toda a montagem do tecido. Este modelo de transgénico fornece uma leitura rápida vascular sem qualquer aplicação de rotulagem intravascular ou imuno-histoquímica toda a montagem. Para analisar a retinopatia diabética no zebrafish, uma rotina passo a passo e padronizada de preparação deve ser usada por cada Dissecador.O seguinte protocolo de preparação fornece outros grupos de pesquisa a opção facilmente avaliar alterações vasculares nos vasos expostos do olho adulto zebrafish e fornecer orientação para estabelecer uma rotina de dissecação otimizado para a retina de zebrafish.

Protocol

Todos os procedimentos, incluindo as etapas relacionadas com assuntos animais, foram aprovados pelo Comitê de ética de animais (Regierungspräsidium Karlsruhe) e sigam as orientações de cuidados com animais da Universidade de Heidelberg. 1. preparação de fixador (4% PFA/PBS) Prepare fixador fresco todos os dias para assegurar a conservação ideal da integridade do tecido histológicas. Dissolva 0,2 g de hidróxido de sódio (NaOH) em água bidestilada 90 mL (ddH2O), agitando constantemente à temperatura ambiente. Adicionar paraformaldeído 4G (PFA) e mexa até que a solução é completamente clara pelo menos 5-10 min para assegurar a despolimerização das macromoléculas.Atenção: PFA é tóxico, manuseie com cuidado. Dissolver 0,84 g de fosfato de-hidrogenofosfato de sódio (NaH2PO4) na solução e controlar o pH em 7.2 através de medição. Ajustar o volume a 100 mL com DDQ2O e filtrar a solução através de papel de filtro de grau 3. Loja 4% PFA/PBS no gelo. 2. preparação da solução de eutanásia Nota: As etapas a seguir foram feitas com a estirpe do selvagem-tipo zebrafish ABTL em geral idade de 6-8 seg. Use o sulfonato de metano 3-aminobenzoato etílico, também chamado “tricaina” ou MS-222, em uma concentração de 0,31 mg/mL para o zebrafish eutanásia16. Utilize 1 x ovo de água, usada para criar embriões de peixe-zebra, como solvente para a solução de eutanásia. Geralmente, controlar a profundidade de anestesia correta antes de trabalhar com peixe sedado demonstrando perda de equilíbrio e perda de reação de toque. Para atingir 1.000 mL de água ovo de 10x, adicionar estes sais de água bidestilada 1.000 mL (ddH2O), agitando constantemente na seguinte ordem: 10 g de NaCl, 0,3 g de KCl, 0,4 g de CaCl2 *6 H2O, 1,32 g MgSO4 *6 H2O. 3. fixação do tecido de Zebrafish Transferi 6 mL 4% PFA/PBS solução por amostra para os poços de placas boas seis antecipadamente. Eutanásia o zebrafish adulto (anteriormente mantido em um ciclo luz-dia padrão, por exemplo, 12 h: 12 h) 2 h após luzes ligar pela manhã, colocando-os na solução tricaina e esperem até que eles chegaram a eutanásia. Após a cessação do movimento odontódios, o que pode levar até 10 min. Tirar o peixe da solução de eutanásia tricaina e colocá-los em toalhas de papel fresca. Secar o peixe e usar um bisturi para cortar as cabeças por trás do opérculo (ver Figura 2A). Transferi as cabeças diretamente para as placas bem preparadas, que contêm o fixador preparado na hora. Loja bem placas contendo as cabeças de peixes a 4 ° C durante a noite para pelo menos 24 h assegurar o fixador penetra as camadas mais profundas da retina.Nota: O Zebrafish cabeças podem ser armazenadas por um período máximo de 48 h em 1 x solução salina tamponada fosfato (PBS) a 4 ° C antes de preparação sem uma perda relevante de intensidade do sinal de fluorescência. Latência aumentada pode levar à perda da integridade do tecido e reduzida qualidade de imagem e, portanto, deve ser evitada. 4. preparação da vasculatura da retina de Zebrafish Encha um prato de petri até um terço com aquecida agarose 2% e esperar até que o agar é firme. Cobrir a placa de ágar com 1X PBS para criar um espaço para dissecar os olhos.Nota: Isto permitirá que ambos preservação de pinças de preparação e de baixa pressão sobre o tecido enquanto dissecando, reduzindo a probabilidade de danos estruturais. Todas as etapas de preparação adicionais devem ser realizadas neste espaço de trabalho utilizando #5 pinças reta com dicas bem sob um microscópio dissecação com epi-iluminação adicional. Enquanto dissecando, use ampliação entre x 4,0 e 6,0 x para permitir visão geral e a avaliação orientada para o detalhe do tecido. Transferir a amostra fixa para o prato de petri e, segurando a cabeça na superfície de corte com uma pinça, inserir outro fixado em conjunto pinça abaixo o globo ocular na cavidade orbital. Lentamente abra a pinça abaixo do olho e aperto o nervo óptico, em seguida, cuidadosamente rasgar e desanexar os olhos (Figura 2B). Figura 2: remoção do olho adulto zebrafish. Vista lateral da córnea com o olho ainda na cavidade orbital e nervo óptico intacto (A). Vista de lado da córnea com olho destacado (B). Representação esquemática do zebrafish olho neste passo (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Remover qualquer uma das quatro reto e dois músculos extraoculares oblíquos que ainda estão conectados para o olho, bem como o tecido extra-oculares residual, conectando o olho à cavidade orbital (compare Figura 3 e Figura 4). Conseguir este segurando o olho através de uma pinça semi-cerrados e, segurando a estrutura com a outra pinça, suavemente arrancá-lo com um movimento diametral. Desde que segurando o globo ocular diretamente conduz à ruptura do vaso interno, esta técnica é apropriadamente suave para preservar a vasculatura. Figura 3: olho de zebrafish adultos com músculos extra-oculares em foco. Vista lateral com acessório de um músculos extraoculares à borda esquerda exterior do globo ocular em foco (A). Vista lateral de nervo óptico com músculos extraoculares simetricamente flanqueando o nervo óptico (B). Representação esquemática do zebrafish olho neste passo (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Use uma agulha descartável 27G (0,4 x 19 mm) para perfurar a córnea (Figura 4, seta vermelha) na faixa exterior. Através desta abertura segura a córnea com ambas as pinças e rasgá-la ligeiramente aberta. Depois cuidadosamente trabalha para criar uma lágrima centrada aproximadamente o tamanho da pupila respectivo. Figura 4: olho de zebrafish adulto após a remoção de todos os músculos extraoculares. Vista lateral com borda exterior limpa da ocular globo visível (A).Vista lateral de nervo óptico com nervo óptico no meio. A esclera de luz refletindo não está cobrindo toda a área ao redor do nervo (tracejado vermelho) (B). Representação esquemática do zebrafish olho neste passo (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Aplique pressão no lado da córnea do globo ocular (bulbus oculi) na borda externa da córnea acima da íris. Isto irá criar uma pequena amolgadela e empurre a lente para a altura do rasgo da córnea. Executar a pinça sob a lente e removê-lo (Figura 5A). Figura 5: olho de zebrafish adulto no processo de remoção da lente. Vista lateral da córnea com a lente empurrado através da rasgo da córnea (A). Vista lateral da córnea com a lente ao lado do globo ocular (B). Representação esquemática do zebrafish olho neste passo (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Vire o olho de cabeça para baixo para o nervo óptico, enfrentando o pesquisador. Observe que a esclera e a córnea estão ligados e formam a túnica fibrosa do bulbo do olho, para proteger a retina em forma de taça. (Figura 6). Esta concha, consistindo a córnea e a esclera, também é chamada de “corneosclera” e peças de reposição para fora a área em torno do nervo óptico (Figura 4B, linha tracejada vermelha). Inserir uma agulha nesta descontinuação uma vez para criar uma abertura entre a esclera e a retina. Figura 6: Corneosclera consistindo de esclera e córnea, que é desconectada do restante tecido intra-ocular. Vista do lado da córnea mostrando a continuação da córnea translúcida em esclera pigmentada (A). Vista lateral focado na parte scleral da corneosclera (B). Representação esquemática do corneosclera removido (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Usando este acesso com ambos uma pinça, cuidadosamente rasgar a esclera axialmente em listras para aumentar a abertura em torno do nervo óptico. Tenha cuidado para manter o corneosclera intacto na transição para a circunferência do lado da córnea (ver figura 6A). Segure a esclera com uma pinça e, agarrando o nervo óptico com o outro e se afastando, inteiramente remover o corneosclera do olho e descartá-lo (Figura 6). Tente cortar todas as conexões antes de separar o corneosclera e o restante tecido intra-ocular, como acessório para outras estruturas será um ponto crítico; Esta etapa irá fornecer uma estrutura em forma de taça, consistindo da Úvea e retina contendo vasculatura da retina (Figura 7). Crie uma ruptura na camada da coroide/RPE mantendo uma agulha 27G lateralmente para a Copa do restante enquanto raspar a superfície externa com a borda da ponta da agulha. Use a ruptura como um ponto de acesso para começ um aperto na camada da coroide/RPE e rasgá-lo com ambas as pinças em listras, mas manter a conexão para a íris intacta. Em seguida, executar uma pinça sob a íris e dar a volta em um circuito de fora enquanto criando tensão puxando na camada da coroide/RPE descontinuada para alcançar o desprendimento da estrutura combinada.Nota: A íris deve ser desligada, por forma a não obstruir a fluorescência enquanto visualizando os vasos (Figura 8B). Agarrando a íris diretamente para removê-lo pode originar lesões nos vasos extensa, especialmente no círculo óptico (COI), desde que a íris ainda está conectada para o tecido circundante. A camada da coroide e o epitélio pigmentado da retina (RPE) podem ser separados e muitas vezes mantém uma conexão para a íris, o que permite uma fácil remoção secundária. Se partes da íris não podem ser removidas, utilize um ponto de ruptura natural que o olho de peixe-zebra adulta exibe dentro da camada de fotorreceptoras (PL), de forma semelhante ao passo 4.9, para remover a íris. Raspe-se sobre a parte externa da retina em forma de xícara restante para induzir a descontinuação no PL acima o ponto de ruptura (Figura 11, seta preta). Use o acesso criado para remover a parte superior da camada mantendo a possível conexão com o iris intacto. Depois, execute a pinça sob a íris e dar a volta em um circuito como mencionado antes, para separar a estrutura combinada.Nota: Um deve exercer a paciência como a etapa inteira 4.9 pode ser difícil, mas esse cuidado vai conseguir um resultado melhor vascular do que forçar uma abertura, destruindo as conexões para a coroide/RPE ou agarrando a íris na borda da pupila direta ou camada de fotorreceptoras sem sua respectiva remoção. Seguir este passo assim irá preservar a integridade vascular da retina, mas levar a danos das camadas externas da retina. Figura 7: olho de zebrafish adulto após a remoção do corneosclera. Vista lateral mostra o tecido restante intra-ocular com intacta íris e nervo óptico (A). Vista lateral da córnea com íris em foco (B). Representação esquemática do zebrafish olho neste passo (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Use uma tesoura de mola microdissection com uma aresta de corte reto 2,5 mm para cortar o nervo óptico, tão próximo quanto possível da retina; Isto permitirá uma melhor plano-montagem do tecido. Figura 8: olho de zebrafish adulto após remoção da RPE/coroide e truncado de nervo óptico. Vista lateral para o nervo óptico mostra a retina com um nervo óptico truncado (A). Vista lateral da córnea com um olhar direto para a camada mais interna da retina (B). Representação esquemática do zebrafish olho neste passo (C).Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 5. montagem da vasculatura da retina Lave a retina dissecada duas vezes por 5 minutos em 1X PBS. Para transferir a retina depois de truncamento do nervo óptico, utilize uma espátula de laboratório com um final de micro colher para evitar a manipulação direta do tecido exposto. Coloque uma gota de PBS numa lâmina de vidro e transferir a retina para a gota. Use uma pinça para manter o tecido no lugar enquanto cortava a estrutura em forma de taça com um bisturi para criar uma forma plana pétala de quatro ou cinco pétalas, dependendo do tamanho da retina (ver Figura 9). Aspire a resto PBS com um bom pedaço de papel. Tenha cuidado para não tocar na retina. Casaco de retina plano montado no suporte de montagem e cobrir com uma lamela. Esteja atento para não criar espuma, como bolhas de ar podem distorcer a visualização dos vasos da retina. Minimizar o movimento da lamela e sele a tampa com esmaltes claros. 6. visualização da vasculatura da retina Manter o intervalo de tempo entre a preparação e visualização tão curta quanto possível reduzir a perda de detalhe de imagem através de perda de sinal de fluorescência. Armazenar as montagens da vasculatura da retina preparado a 4 ° C para reduzir a perda de sinal, se visualização directa não pode ser alcançada, como degradação da qualidade da imagem lentamente se torna visível 48 h após a preparação. Visualizar as montagens da vasculatura da retina através de microscopia de fluorescência ou microscopia confocal de varredura a laser.Nota: Visualização de navio por microscopia de fluorescência foi alcançada na ampliação de x 2,5 com um tempo de exposição de 2,0 s, ganho de 6,0 x e gama configurações de 1,67. Para a microscopia confocal, um Ar-laser (488 nm/20 mW), a potência de 20% foi utilizado em combinação com um filtro de excitação de TD 488/543/633, 20 x / 0,7 objectivo de imersão multi at com DDQ2O como mídia de imersão e configurações de filtro de emissão de 505-560 nm. Confocal fotos são compostas de 4 x 4, 4 x 5 ou 5 x 5 imagens singular combinadas através de uma varredura de telha, dependendo do tamanho da retina. 7. que seções da Retina Zebrafish Nota: Para seções da retina zebrafish, preparar o tecido, conforme descrito no protocolo até o passo 4,5 e depois saltar directamente para o passo 7.1. Lave os olhos sem núcleo (depois passo 4.5) duas vezes por 5 minutos em 1X PBS. Depois, transferi o tecido em 70% etanol (EtOH). Neste ponto, olhos preparados podem ser armazenados a 4 ° C até a incorporação de parafina. Lave o tecido da seguinte maneira para desidratá-lo antes de incorporação de parafina: 2 x 15 min em 80% de etanol, 2 x 15 min em 90% etanol, 3 x 15 min em etanol a 96%, 3 x 15 min em 99% de etanol, 2 x 15 min em acetone/99% etanol (1:2), 3 x 15 min em acetona. Manter o tecido em parafina a 62 ° C durante a noite. Aqueça a parafina fresca a 62 ° C e despeje em moldes de incorporação. Transferi o tecido em moldes diretamente e, em um rápido ritmo, controle de orientação correta dos olhos para a seção desejada. Depois, aplica uma gaveta de incorporação para o molde e cubra com a parafina aquecida adicional. Remova os moldes de encastre depois arrefeceram blocos de parafina. Cortar os blocos de parafina em um micrótomo em 10 seções µm e flutuar para fora em um banho de água de 45 ° C na superfície da água o tempo suficiente para eles a achatar-se completamente. Pegar as seções sobre uma lâmina de vidro e drená-los verticalmente para remover o excesso de água antes da secagem-los durante a noite em um forno a 45 ° C. Processo as seções mais com o seguinte calendário para deparaffinize e mancha: 4 x 1 min em xilol, 1 x 1 min no álcool etílico 99%, 1 x 1 min em etanol a 96%, 1 x 1 min em etanol a 80%, 1 x 1 min em etanol a 70%, 1 x 1 min em ddH2O, 1 x 4 min em hematoxilina de Mayer , 1 x 10 min em ddH2O, 1x2min em 0,5% eosina, 1 x 30 s em ddH2O, 1 x 30 s em 80% de etanol, 2 x 30 s em etanol a 96%, 3 x 1 min em 99% de etanol e 1 x 1 min em xilol. Pegue a lâmina de vidro fora o xilol e cobrir rapidamente o tecido com meios de montagem. Evite para deixar o tecido secar completamente, então coloque uma lamela por cima e selar o tecido manchado.

Representative Results

Aqui vamos mostrar dois exemplos típicos de morfológicos da vasculatura da retina em adultos tg(fli:EGFP) zebrafish: uma vez visualizadas com um microscópio de fluorescência (Figura 9A) e uma vez com um laser confocal microscópio (Figura 9B). A estrutura da retina revelada mostra um padrão altamente organizado. Autofluorescência forte é vista na retina zebrafish, quando visualizadas com um microscópio de fluorescência. Assim, aconselha-se uma visualização de apenas a camada vascular através de uma varredura confocal fluorescência de fundo de reduzir e aumentar o contraste. Para mais rápida aquisição de imagens ou situações onde dados qualitativos são suficientes, o microscópio de fluorescência é uma alternativa atraente. Figura 9: fotos representativas da vasculatura da retina do zebrafish adulto tg(fli:EGFP). Dois exemplos típicos de morfológicos da vasculatura da retina são mostrados: artéria central óptica se espalha em vasos principais de 5-7, que depois se ramificam em uma sucessão de arcadas. Todos os navios mais drenam para a veia circunferencial (CV), limitando a parte externa de cada pétala. Visualização através de microscopia de fluorescência em 2.5 x ampliação (A). Visualização da vasculatura da retina por laser confocal, microscopia através um combinado scan telha única imagem de 5 x 5 (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. A artéria óptica penetra a retina na cabeça do nervo óptico e, na maioria das amostras, espalha-se em 5-7 principais vasos (Figura 10A). Os principais vasos então ramificar em uma sucessão de arcadas e conectar a óptico círculo interno (COI), também chamado a veia circunferencial (CV), circundando o disco óptico na periferia da retina montada plana (ver Figura 10B). O IOC é o vaso venoso que drena o sangue arterial na borda interna do globo ocular (bulbus oculi). Vasculatura da retina zebrafish também mostra áreas de alta atividade vascular com ramificação dos vasos capilares e angiogênico brotação (Figura 10). Esta atividade vascular situa-se principalmente na proximidade de perto para o COI. É importante notar que o mesmo olho pode demonstrar as duas atividades de alto e baixo vasculares em diferentes regiões da retina (compare Figura 10B e Figura 10). Em geral, a vasculatura da retina do zebrafish mostra mais espaço avascular e menos capilares entre os ramos principais se comparado com, por exemplo, a retina de ratos17. Ambos os olhos de cada amostra devem ser analisados porque a vasculatura pode variar entre e inspeção singular pode levar ao preconceito. Figura 10: ampliada áreas de visualização de vasculatura da retina de zebrafish adulto tg(fli:EGFP). A artéria óptica ramificando em vasos principais (A). Capilares da retina em uma área de baixa atividade vascular ligando para o círculo interno de óptico (IOC) na parte inferior da imagem (B). Capilares da retina em uma área de alta atividade vascular conectando ao IOC (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Uma arquitetura altamente conservada de camadas neuronais já está presente no zebrafish de aproximadamente 72 h pós fertilização (hpf) a partir de18. A retina de zebrafish adulto mostra as seguintes camadas de dentro para fora (Figura 11): camada de células ganglionares (GCL), camada plexiforme interna (IPL), camada nuclear interna (INL), camada plexiforme exterior (OPL), camada nuclear externa (ONL), camada fotoreceptoras (PL), e o epitélio pigmentado da retina (RPE). A estimativa dos parâmetros vasculares de visualização da vasculatura da retina é mostrada na Figura 12. Vasculatura da retina interna situa-se na camada de células ganglionares (GCL) (Figura 13B, caixa branca) enquanto a coroide capilares deve ser associados com o epitélio pigmentado da retina (RPE). Figura 11: ele mancha do olho adulto zebrafish. Visão transversal do olho todo após a remoção da lente (A). Camadas da retina do zebrafish adulto olho19 (B). Indicação (seta preta), do ponto de quebra natural no PL (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Modelos de neoangiogênese retiniana induzida por hipóxia mostram aumento do número de pontos de ramificação, angiogênico sprouts, área total de vascular e diminuição da distância intercapilar em zebrafish²⁰. Estes resultados suportam a ideia de que o peixe-zebra é suscetível a complicações microvasculares diabéticas²¹, as principais conclusões de mais tarde retinopatia diabética incluem neoangiogênese mediada por hipóxia, que está fortemente ligada à expressão de VEGF. Induzida pela hiperglicemia alterações na retina zebrafish levam a espessura aumentada dos vasos, mas mantêm a total padronização²². Alternando a imersão em soluções de glicose por 30 dias também diminui a espessura da IPL e INL²³. A influência direta dos metabolitos de glicose no zebrafish como proponentes metabólicos da vasculopatia também já foi mostrada. Hyperbranching vascular adicional foi observada na vasculatura-tronco de embriões de peixe-zebra após incubação com metilglioxal²⁴. No momento, não há nenhum modelo animal que fornece todos os critérios-chave da retinopatia diabética. As alterações iniciais são frequentemente encontradas, mas a progressão de retinopatia diabética proliferativa está faltando²⁵. O zebrafish também cai nesta definição, como nós só vimos neoangiogênese mediada por hipóxia ou induzida pela hiperglicemia alterações até agora. Os resultados atuais apoiam a ideia de que o peixe-zebra é suscetível a alterações vasculares mediada por hiperglicemia e como um modelo animal potencialmente pode mostrar uma progressão de retinopatia diabética proliferativa. Dependendo da força e da exposição ao efeito mediada por hiperglicemia, o modelo experimental bem poderia levar à isquemia em certas áreas da retina zebrafish e promover a neoangiogênese como os critérios-chave da retinopatia diabética proliferativa. No entanto, como o peixe-zebra é comparàvel novo jogador no campo de modelagem patologias microvasculares a longo prazo, modelos de diabetes programados no zebrafish irão fornecer informações adicionais e esclarecer sua importância em relação a outros modelos e suas patologias. Por exemplo, em uma cruz de tg(gata1a:DsRed) zebrafish com eritrócitos com rótulo vermelho para a linha de tg(fli:EGFP) pode ser usada para visualizar simultaneamente hemorragias intra-oculares potenciais no futuro zebrafish modelos mostrando microaneurismas como preditor de progressão de PDR.

Desde que a vasculatura da retina progride em uma sucessão de arcadas, avaliação da distância de pontuações, número de pontos de ramificação e a área total de vascular estão relacionados com a distância da artéria central da óptica. Para evitar distorções nos parâmetros avaliados vasculares, um ponto de orientação é necessário. O IOC é essa estrutura e altamente relevante desde que áreas de atividade vascular mentem na proximidade espacial direta. Para uma avaliação consistente, o exame de retina deve ser dividido em várias seções de imagem retangular com uma distância consistente para o COI. A retina inteira deve ser analisada e imagens numericamente simetricamente distribuídos. A retina de zebrafish mostra áreas com densidade alta e baixa capilar e uma distribuição desigual das seções de imagem pode levar a viés adicionais.

Figura 12: apresentação de exemplo de parâmetros vasculares como leitura de visualização da vasculatura retiniana. Medição de distância de pontuações (seta dupla vermelha) perto a óptica interna do círculo (IOC) (A). Três pontos de ramificação (círculos vermelhos) perto do IOC (B). Visualização de zebrafish vasculatura da retina com uma área ampliada (caixa vermelha) mostrando um navio de germinação (C). Diâmetro do vaso medidos sobre uma certa distância (seta dupla branca) da artéria central (cruz branca) (D). Densidade do navio é a porcentagem de retina área ocupada pela sobreposição de navios (diagonal linhas vermelhas) (E). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para medir a distância de pontuações, um precisa de uma certa distância para o COI pré-configurados (Figura 12A, branca seta dupla) e desenhe uma linha horizontal imaginária (Figura 12A, linha branca horizontal) paralelo para o COI. A distância entre os navios nesta linha somados e aritmeticamente em média é igual a distância de pontuações. Pontos de ramificação são contados dentro de cada imagem, sempre que um navio se divide e mais de um lúmen vascular continuar do ponto de origem. Isto também inclui conexões horizontais entre capilares. É importante ficar consistente com a análise e decidir quais pontos de ramificação para contar e manter essas regras ao longo de todo o experimento para reduzir variação desnecessária. Brotação vascular, conforme demonstrado na Figura 12, é outro parâmetro que pode ser contado em cada imagem para avaliar a influência na vasculatura da retina. Angiogênico brotos não seguem a sucessão de arcade, como entre a artéria central e IOC e foco perto partes exteriores da retina. Um ponto de orientação para avaliar determinados diâmetros de navio, é sempre necessário do qual uma distância definida marca a medição pontual. Origem da artéria central dentro da retina fornece orientação para as embarcações da haste principal (Figura 12D, branco Cruz). A área ocupada pelos navios (Figura 12E, diagonal linhas vermelhas) como uma porcentagem da área inteira da retina é a densidade vascular e indiretamente se correlaciona com a área avascular.

Uma varredura confocal completa de uma amostra deve ser composta de várias imagens de alta-detalhe para permitir a visualização de pequena hypersprouting capilar. Para otimizar o tempo e os recursos gastos nesta etapa, um procedimento automatizado de lavra deve ser usado com uma profundidade de verificação geral para cada telha. Montagem irregular da retina pode aumentar significativamente o tempo gasto para digitalizar a vasculatura com um microscópio confocal. Em uma abordagem ideal um gostaria de analisar apenas a camada vascular (Figura 13B, caixa branca), mas a inclusão parcial do GCL é muitas vezes necessária.Deixar um excesso de comprimento do nervo óptico após o truncamento, bem como os cortes para alcançar a plano de montagem sendo demasiado curto, pode levar a montagem desigual.

Figura 13: comparação de ele mancha e autofluorescência na retina adulto zebrafish. Vasculatura da retina em foco acima o GCL (A). Vasculatura da retina (caixa branca) mostrando verde, um sinal EGFP e camadas da retina, exibindo forte autofluorescência (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Como a preparação apropriada da vasculatura da retina zebrafish precisa de treinamento prévio, um tamanho de amostra pequeno com dissectors destreinados e fortemente diferentes resultados de preparação são uma limitação principal da técnica. Enquanto a preparação de tg(fli:EGFP) zebrafish olhos dá rápido insight sobre o estado da vasculatura, a técnica ainda utiliza em torno de 20 min de tempo de trabalho por retina para um pesquisador experiente. Todas estas etapas de preparação para a vasculatura da retina devem ser realizadas sob um microscópio de dissecação e dissectors precisam ficar concentrados o tempo todo como um passo descuidado pode potencialmente induzir ruptura do vaso. O Dissecador deve praticar regularmente como uma ausência prolongada de preparação reduz a probabilidade de um Dissecador de manter a integridade da embarcação.

Além disso, uma leitura adicional através de imuno-histoquímica (IHC) ainda é limitada, como apenas um pequeno número de anticorpos validados no tecido humano e roedor está trabalhando com zebrafish. Interessado em IHC experimentadores são aconselhados a procurar anticorpos específicos zebrafish, especialmente quando se trabalha com novos destinos. Como alternativa, é aconselhável usar linhas de repórter de zebrafish adicionais que são úteis para estudar células além da vasculatura no olho. Esta estratégia, no entanto, é demorada, como leva alguns meses para gerar linhas de zebrafish adulto que carregam vários repórteres transgénicos.

Não obstante, o zebrafish representa um único conjunto de vantagens. Eles são relativamente pequenos e reproduzem facilmente. Podem crescer rapidamente para estágios adultos e seus embriões são ideais para despistagem de drogas. O campo está crescendo rapidamente e mais literatura está se tornando acessível. Com a capacidade de gerar nocautes de gene a uma velocidade rápida e uma abundância de linhas de repórter de fluorescência do transgene, a escolha para zebrafish só está cingida pela questão de pesquisa escolhido.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostaria de agradecer Katrin Bennewitz e Marlene Hausner zebrafish pecuária e assistência técnica. Os autores reconhecem o apoio do núcleo instalação Live Cell Imaging Mannheim no centro para biomedicina e medicina tecnologia Mannheim (DFG INST 91027/9-1). Este estudo foi suportado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (grupo de formação 1874/1 pesquisa internacional “DIAMICOM”, do projeto SP5 e SP9; SFB1118 de centro de pesquisa colaborativa, projeto B1 e centro de pesquisa colaborativa SFB/TR23 projeto Z5).

Materials

NaOH	Roth	6771.3
KCl	Merck	1.04936
CaCl_2*6H₂0	Roth	5239.2
MgSO_4*7H₂0	Merck	1.05886.0500
Paraformaldehyd	Roth	0335.3
Sodium dihydrogen phosphate	Roth	2370.1
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (MS-222,Tricaine)	Sigma	A5040
PBS	Roth	9143.1
Agarose	Roth	2267.3
Fluoromount-G	Thermo-Fischer	00-4958-02
Petri dish	Greiner Bio one	633180
Six-well plate	StarLab	CC7682-7506
Needle	MSG Praxisbedarf	BD 300900
Micro Tweezer	World Precision Instruments	14095
Microdissection Scissor	World Precision Instruments	501778
Glass slide	Carl Roth	H872.1
Coverslip 22mmx22mm	neoLab	103512222
Scalpel	MSG Praxisbedarf	FEA111
Epi-Illumination	Leica	10446389
Fluorescence stereomicroscope MZ10 F	Leica	NA
Confocal laser-scanning microscope SP5 DS	Leica	NA
Stereomicroscope M80	Leica	NA
Zebrafish line: Tg(fli:EGFP), ABTL wildtype	NA	NA	see Reference 15
Mayer’s hematoxylin	Dr. K. Hollborn & Söhne	0088663
0.5% eosin	Dr. K. Hollborn & Söhne	NA
99,9% ethanol	Roth	9065.2
Paraffin	Merck	1,071,501,000
Xylol	Roth	4436.2
Acetone	Emsure	606-001-00-8
Microtome RM 2165	Leica	NA

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Cite This Article

Wiggenhauser, L. M., Kohl, K., Dietrich, N., Hammes, H., Kroll, J. Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature. J. Vis. Exp. (130), e56674, doi:10.3791/56674 (2017).