Un romanzo In Vitro Live-imaging dosaggio del Astrocyte-mediata fagocitosi utilizzando pH indicatore-coniugato sinaptosomi
Summary
Questo protocollo presenta un in vitro live-imaging test di fagocitosi per misurare la capacità fagocitica dei astrocytes. Microglia e astrociti di ratto purificati vengono utilizzati insieme a sinaptosomi coniugato con indicatore di pH. Questo metodo in grado di rilevare in tempo reale engulfment e degradazione cinetica e fornisce una piattaforma di screening adatto per identificare i fattori che influenzano la fagocitosi di astrociti.
Abstract
Gli astrociti sono del tipo di cellule principali nel cervello e contattare direttamente le sinapsi e vasi sanguigni. Anche se le cellule microglial sono state considerate le principali cellule del sistema immunitario e fagociti solo nel cervello, recenti studi hanno dimostrato che gli astrociti anche partecipano a vari processi fagocitici, come eliminazione sinaptica inerente allo sviluppo e liquidazione dei placche di beta amiloide nel morbo di Alzheimer (annuncio). Nonostante questi risultati, l’efficienza di engulfment Astrocita e degradazione dei loro obiettivi è chiari rispetto a quello di microglia. Questa mancanza di informazioni è per lo più a causa della mancanza di un sistema di test in cui la cinetica della fagocitosi mediata da astrociti e microglia sono facilmente paragonabili. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo sviluppato un test a lungo termine live-imaging in vitro fagocitosi per valutare la capacità fagocitica di purificato astrociti e microglia. In questa analisi, rilevamento in tempo reale di engulfment e degradazione è possibile tramite sinaptosomi coniugato con indicatore di pH, che emettono fluorescenza rosso brillante in organelli acidi, come ad esempio i lisosomi. La nostra analisi novella fornisce rilevamento semplice ed efficace di fagocitosi attraverso live-imaging. Inoltre, questo test di fagocitosi in vitro utilizzabile come una piattaforma di screening per identificare le sostanze chimiche e composti che possono migliorare o inibire la capacità fagocitica dei astrocytes. Come disfunzione sinaptica potatura e accumulo di proteine patogene sono stati indicati per causare disturbi mentali o malattie neurodegenerative, prodotti chimici e composti che modulano la capacità fagocitica delle cellule glial dovrebbero essere utile nel trattamento di varie disturbi neurologici.
Introduction
Le cellule gliali, che si riferiscono alle cellule non eccitabili nel cervello, sono il tipo principali delle cellule nel sistema nervoso centrale (SNC). In precedenza, le cellule glial erano considerate come semplici cellule di supporto che principalmente giocano un ruolo passivo nel mantenimento della sopravvivenza neuronale e sinaptica basale proprietà. Tuttavia, la prova emergente ha rivelato che le cellule gliali svolgono i ruoli più attivi in vari aspetti della neurobiologia, quali il mantenimento dell’omeostasi del cervello, mediando sinapsi formazione1,2,3 e sinapsi eliminazione4,5e modulante plasticità sinaptica6,7. Astrociti, microglia ed oligodendrociti sono cellule gliali del SNC. Tra queste cellule, astrociti e microglia hanno dimostrato di svolgere ruoli fagocitici inghiottendo sinapsi4,5, di cellule apoptotiche8, detriti neurali9e proteine patogene, quali amiloide beta le piastre10,11. Nel cervello in via di sviluppo, gli astrociti eliminano sinapsi nel nucleo genicolato laterale dorsale (missilistico) attraverso fagocitosi di MERTK – e MEGF10-dipendente4. Allo stesso modo, le microglia eliminano anche rivestite con C1q sinapsi durante fasi di sviluppo attraverso il classico del complemento cascata5. Interessante, è stato suggerito che i difetti in potatura sinapsi possono essere uno degli iniziatori di parecchi disordini neurologici. Ad esempio, è stato indicato che le mutazioni nel componente del complemento 4 (C4), che aumenta la potatura sinapsi complemento-mediata da microglia, sono fortemente associate con la prevalenza della schizofrenia negli esseri umani12. Una carta recente inoltre ha dimostrato che la via classica del complemento è iperattivata nelle fasi di iniziazione dell’annuncio e induce la perdita di sinapsi iniziale in questa malattia13.
Confrontato con la fagocitosi mediata da microglia, se fagocitosi mediata Astrocita contribuiscono all’avvio e alla progressione di vari disturbi neurologici è meno chiaro. Tuttavia, un recente documento suggerisce che fattori che alterano il tasso di potatura normale sinapsi dai astrocytes possono interferire con l’omeostasi del cervello e contribuiscono alla suscettibilità e patologia DC14. Il tasso di potatura di sinapsi dai astrocytes potentemente è controllato dagli isomeri di ApoE , con un allele protettivo per annuncio (ApoE2) migliorando fortemente il tasso e un allele di rischio per l’annuncio (ApoE4) abbassando significativamente il tasso. Inoltre, topi transgenici che esprimono ApoE4 accumulato C1q sinaptica molto di più rispetto a controllo o ApoE2 topi14. Questi dati suggeriscono che alterata fagocitosi Astrocita-mediata nei primi cervello dell’annuncio può indurre l’accumulo di detriti senescenti rivestite con C1q sinapsi/sinaptica che attiva la fagocitosi microglial complemento-mediata, degenerazione sinaptica di guida . L’alterata capacità fagocitica dei astrocytes nei portatori ApoE4 può anche contribuire all’accumulo incontrollato delle placche di beta amiloide nel cervello colpite AD.
Inoltre, esso ha dimostrato che le cellule gliali nel cervello invecchiato Drosophila perdono la loro capacità fagocitica grazie alla traduzione in diminuzione di Draper, un omologo di Megf10 che gli astrociti utilizzano per phagocytosing sinapsi. Il ristabilimento dei livelli di Draper salvato la capacità fagocitica delle cellule gliali, che efficacemente ha eliminato detriti axonal danneggiati nel cervello invecchiato in simile misura come quello nel cervello giovane, che indica che invecchiamento indotto da alterazioni nella capacità fagocitica di gli astrociti possono contribuire alla rottura del cervello omeostasi15.
Basato su queste nuove scoperte, modulando la capacità fagocitica dei astrocytes può essere una strategia terapeutica attraente per prevenire e curare vari disturbi neurologici. A questo proposito, ci sono stati diversi tentativi per migliorare la capacità fagocitica dei astrocytes, ad esempio, inducendo l’acidificazione dei lisosomi con nanoparticelle acide16 e che overexpressing EB (IL2RG), che può migliorare il fattore di trascrizione lisosoma biogenesi17. Nonostante questi tentativi, non è ancora chiaro come astrociti e microglia differenze nella loro cinetica fagocitica e se dovremmo aumentare o diminuire la loro capacità fagocitica in varie malattie.
In questa carta, presentiamo un’analisi novella in vitro per la rilevazione della capacità fagocitica dei astrocytes in tempo reale. I dati mostrano diversa cinetica di engulfment e degradazione in astrociti e microglia. Astrocita-condizionato mezzo (ACM), che contiene fattori secreti dagli astrociti, è essenziale per la fagocitosi efficace di astrociti e microglia. Inoltre, Megf10, un recettore fagocitico in astrocytes e un omologo di Ced-1 e Draper, gioca ruoli critici nella fagocitosi mediata Astrocita8,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo articolo, presentiamo metodi per un lungo termine test di fagocitosi live-imaging in vitro utilizzando cellule gliale purificate e sinaptosomi coniugato con indicatore di pH. Indichiamo che confrontato con microglia, astrociti possiedono diverse capacità engulfment e degradazione durante la fagocitosi dei sinaptosomi. Inoltre, i nostri dati suggeriscono che fattori Astrocita-secreto, che contengono molecole passerella come GAS6, proteine e MEGE8, sono essenziali per efficiente fagocitosi di PS-dipende…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Jung Yeon-Joo per il suo sostegno sperimentale durante la purificazione di synaptosome e Jungjoo Park per le immagini degli synaptosomes con esposizione di PS. Inoltre, ringraziamo tutti i membri nel laboratorio di Chung per utile discussione. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Research Foundation di sovvenzione di Corea (NRF) finanziata dal governo coreano (MSIP) (NRF-2016M3C7A1905391 e NRF-2016R1C1B3006969) (W.-S. C).
Materials
| Synaptosome purification | |||
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2 | BIO-RAD | 5000202 | |
| pH indicator conjugation | |||
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | LPS solution | DMSO100 | |
| pHrodo red, succinimidyl ester | Molecula probes | P36600 | |
| Immunopanning | |||
| 10X Earle’s balanced salt solution (EBSS) | Sigma | E7510 | |
| Bovine serum albumin | Bovogen | BSA025 | |
| Deoxyrebonuclease 1 (DNase) | Worthington | Is002007 | |
| (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| (dPBS) | Welgene | LB001-02 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Griffonia Simplicifolia Lectin(BSL-1) | Vector Labs | L-1100 | |
| Goat anti-mouse IgG+IgM(H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-005-044 | |
| Goat anti-mouse IgM (μ-chain) | Jackson ImmunoResearch | 115-005-020 | |
| Heparin-binding epidermal growth factor | Sigma | E4643 | |
| Human HepaCAM antibody | R&D systems | MAB4108 | |
| Integrin beta 5 monoclonal antibody (KN52) | eBioscience | 14-0497-82 | |
| L-cysteine | Sigma | C7880 | |
| L-glutamate | Gibco | 25030-081 | |
| N-acetly-L-cyteine (NAC) | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| O4 hybridoma supernatant(mouse IgM) | Bansal et al.23 | ||
| Papain | Worthington | Is003126 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluristrainer 20 μm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Purified rat anti-mouse CD45 | BD Pharmingen | 550539 | |
| Purified mouse anti-rat CD45 | BD Pharmingen | 554875 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Trypsin | Sigma | T9935 | |
| Trypsin inhibitor | Worthington | LS003086 | |
| Ultra-clear tube (Tube, Thinwall, Ultra-Clear) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Collect IP-ACM | |||
| Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (10k) | PALL | MAP010C37 | |
| Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (30k) | PALL | MAP030C37 | |
| Phagocytosis live imaging assay | |||
| Juli stage | NanoEntek | ||
| Time Series Analyzer V3 plugins | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html |
References
- Singh, S. K., et al. Astrocytes Assemble Thalamocortical Synapses by Bridging NRX1alpha and NL1 via Hevin. Cell. 164 (1-2), 183-196 (2016).
- Allen, N. J., et al. Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via GluA1 AMPA receptors. Nature. 486 (7403), 410-414 (2012).
- Xu, J., Xiao, N., Xia, J. Thrombospondin 1 accelerates synaptogenesis in hippocampal neurons through neuroligin 1. Nat Neurosci. 13 (1), 22-24 (2010).
- Chung, W. S., et al. Astrocytes mediate synapse elimination through MEGF10 and MERTK pathways. Nature. 504 (7480), 394-400 (2013).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
- Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour. Nature. 539 (7629), 428-432 (2016).
- Parkhurst, C. N., et al. Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
- Iram, T., et al. Megf10 Is a Receptor for C1Q That Mediates Clearance of Apoptotic Cells by Astrocytes. J Neurosci. 36 (19), 5185-5192 (2016).
- Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. Astrocytes engage unique molecular programs to engulf pruned neuronal debris from distinct subsets of neurons. Genes Dev. 28 (1), 20-33 (2014).
- Jones, R. S., Minogue, A. M., Connor, T. J., Lynch, M. A. Amyloid-beta-induced astrocytic phagocytosis is mediated by CD36, CD47 and RAGE. J Neuroimmune Pharmacol. 8 (1), 301-311 (2013).
- Wang, Y., et al. TREM2 lipid sensing sustains the microglial response in an Alzheimer’s disease model. Cell. 160 (6), 1061-1071 (2015).
- Sekar, A., et al. Schizophrenia risk from complex variation of complement component 4. Nature. 530 (7589), 177-183 (2016).
- Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352 (6286), 712-716 (2016).
- Chung, W. S., et al. Novel allele-dependent role for APOE in controlling the rate of synapse pruning by astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (36), 10186-10191 (2016).
- Purice, M. D., Speese, S. D., Logan, M. A. Delayed glial clearance of degenerating axons in aged Drosophila is due to reduced PI3K/Draper activity. Nat Commun. 7, 12871 (2016).
- Loov, C., Mitchell, C. H., Simonsson, M., Erlandsson, A. Slow degradation in phagocytic astrocytes can be enhanced by lysosomal acidification. Glia. , (2015).
- Xiao, Q., et al. Enhancing astrocytic lysosome biogenesis facilitates Abeta clearance and attenuates amyloid plaque pathogenesis. J Neurosci. 34 (29), 9607-9620 (2014).
- Lu, T. Y., et al. Axon degeneration induces glial responses through Draper-TRAF4-JNK signalling. Nat Commun. 8, 14355 (2017).
- Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3 (11), 1718-1728 (2008).
- Stigliani, S., et al. Glia re-sealed particles freshly prepared from adult rat brain are competent for exocytotic release of glutamate. J Neurochem. 96 (3), 656-668 (2006).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
