3D 미토 콘 드 리아 열 대권 외의 직렬 섹션 전자 단층 촬영에 의해 밝혀 초파리 간접 비행 근육의
Summary
이 프로토콜, 초파리 간접 비행 근육의 미토 콘 드리 아 구조를 명료 하 게 직렬 섹션 전자 단층 촬영의 응용 프로그램 보여 줍니다.
Abstract
미토 콘 드리 아 ATP, 지질, 및 대사 산물, 뿐만 아니라 칼슘 항상성 및 세포 죽음 통제 세포 강국은. 이 세포 기관이의 독특한 cristae 풍부한 이중 막 열 대권 외 우아하게 생체를 분할 하 여 여러 기능을 수행 하기 위해 배열 된다. 열 대권 외의 미토 콘 드 리아는 연결 되어 속속들이 다양 한 기능; 그러나, 이러한 구조-기능 관계의 좋은 정보는 설명에 시작 됩니다. 여기, 우리가 초파리 간접 비행 근육의 미토 콘 드리 아 구조를 명료 하 게 직렬 섹션 전자 단층 촬영의 응용 프로그램을 보여 줍니다. 직렬 섹션 전자 단층 촬영 3 차원에서 어떤 세포질 구조 연구에 적용할 수 있습니다.
Introduction
전자 현미경 subcellular 어셈블리 및 세포질 과정을 수행 하는 세포의 구조적 맥락을 연구 하는 귀중 한 도구입니다. 방법은 알데하이드와 화학 기정에 의해 조직이 나 세포의 열 대권 외를 보존 하기 위해 개발 되었습니다 또는 높은 압력에 의해 대체 (FS)1,2동결 동결 (HPF) 다음. 포함 된 견본 블록 있습니다 수 sectioned, 스테인드, 그리고 전송 전자 현미경 (TEM)으로 관찰 합니다. HPF 표본 수 또한 처리 cryo-조건 같은 곳을 알아내는 단면 또는 집중 된 이온 빔 (FIB) 밀링, 및 곳을 알아내는-EM3,4에 의해 관찰.
얇은-섹션 안에 유익한 형태학 통찰력 제공, 하지만 결과 2D 이미지만 특정 횡단면의 열 대권 외를 밝힐 수 있다. 3D 볼륨에서 열 대권 외의를 구성 하는 방법을 가려진 남아 있습니다. 세포 열 대권 외의 3 차원에서 시각화를 위해서는 전자 단층 촬영 방법 틸트 이미지의 시리즈 인수 하 고 다시 단층 촬영 개조5 (그림 1)을 생성 하 예상 했다 개발 되었다. 이중 기울기 시리즈 샘플 90 °를 회전 하 고 두 번째 기울기 시리즈를 취득 하 여 수집할 수 있습니다. 이 제한 된 샘플링 각도에서 발생 하는 tomogram의 해상도 개선 누락 쐐기 아티팩트 최소화 됩니다.
여기, 우리는 초파리 간접 비행 근육 (IFM)6,7,,89 의 열 대권 외의 미토 콘 드리 아 연구 직렬 섹션 전자 단층 촬영의 응용 프로그램 설명 . 3D 복원 전체 미토 콘 드리 아 (약 2.5 µ m 두께) 취재를 얻으려면 직렬 섹션 초파리 IFM 조직 블록에서 얻은 했다. 각 섹션의 Tomograms 자동 데이터 수집 소프트웨어를 사용 하 여 개별적으로 수집 했다. 단층 촬영 개조 했다 생성 하 고 직렬 tomograms를 전체 mitochondrion의 재건된 볼륨 아이 모드 패키지와 함께 합류 했다. 결합 된 tomograms는 3D 소프트웨어에 의해 분석 되었다. Cristae 미토 콘 드리 아의 밀도 3 차원에서 조직 공개 세분화 모델을 생성 하 세그먼트 했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서 우리는 직렬 섹션 전자 단층 촬영 3D 미토 콘 드 리아 열 대권 외의 초파리 간접 비행 근육의 연구에 적용 하기 위한 최적화 된 워크플로 설명 합니다. 샘플에서 열 대권 외의 보존은 분석의이 유형에 대 한 기본 기술 도전 이다. 위해 최고의 열 대권 외의 두 방법론 단계 포함 되었습니다. 첫째, 조직 조직 아키텍처를 가능한 한 많이 유지 블레이드 톰을 진동으로 단면에 의해 샘플링 되었다. 둘째, HPF/FS 프로토콜 포함된 견본 블록의 준비 하는 동안 세포 기관이 열 대권 외의를 유지 하기 위해 최적화 되었다. 표본 높은 압력, 물의 어는 점을 손상 열 대권 외1얼음 결정의 형성을 감소 시킨다는 동결 했다. 표본으로 0.1 m m 두께 즉시 vitrified 고 EM 분석을 위한 견본 블록을 생성 하는 대체 동결 대상이 될 수 있습니다. HPF/FS로 열 대권 외의 향상 된 보존, 화학 고정 방법에 비해 지적 했다. 이 일련의 단계를 사용 하 여 샘플 준비, 미토 콘 드 리아 이중 막과 cristae 막의 보존 극적으로 개선 되었다.
시료의 직렬 섹션을 얻는 방법의 가장 어려운 단계입니다. 으로 전자 빔 침투 전력 제한, 섹션의 두께 어느 250 또는 500 nm 200에서 가장을 사용 하 여 k v 또는 300 kV, 각각. mitochondrion의 두께 이상의 2 µ m 일 수 있으므로 직렬 섹션 전체 볼륨 복원을 얻기 위해 필요 합니다. 그러나, 전체 세포 기관이 되도록 직렬 섹션의 충분 한 수를 복구 하는 것은 기술 도전 이다. 트리밍는 사다리꼴의 기초 사이 가능한 평면 수 블록 얼굴 슬롯 눈금 더 많은 부분을 수용 하 고 따라서 더 큰 볼륨을 커버 수 있습니다. 또한, 얇은 섹션에 대 한 완벽 한 루프를 사용 하 여 직렬 섹션 그리드 전송 성공률을 증가 합니다.
표준 안에 핵심 장비와 직렬 섹션 전자 단층 촬영을 수행할 수 있습니다. 그러나, 메서드는 기술적 제한에서 발생 하는 몇 가지 피할 수 없는 제한이 있습니다. 하나는 자료 직렬 섹션, 조인된 재건에 격차를 떠나 사이 필연적으로 손실입니다. 두 번째 달성 제한 기울기 각도 때문에 발생 하는 누락 된 쐐기 유물이 이다. 이 제한에는 견본 홀더 전자 빔 차단 하지 않고 전체 회전에 설정할 수 없습니다 때문에 발생 합니다. 이러한 제한에도 불구 하 고 직렬 섹션 전자 단층 세포와 세포 기관이 열 대권 외의 차원에서 공개를 충분 한 확인을 합니다.
작은 규모 이미징, cryo 전자 단층 촬영은 고분자 복합물 및 어셈블리에 현장에서 함께 하위 단층 또는 하위 angstrom 해상도 구조를 사용할 수 있는 신흥 기술 재건축3. 이 응용 프로그램에서 셀 단면 또는 집중 된 이온 빔 액체 질소에서 밀링 thinned 있다. tomograms 분자 구조는 화학 고정, 탈수, 또는 포함 하지 않고 기본 상태에 가까운 유지 하는 곳을 알아내는-조건 하에서 수집 됩니다. 규모의 다른 쪽 끝에 해상도, 비용 큰 조직의 볼륨을 분석 하 직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사 법은 매력적인 적임 비록 특정 악기4필요 합니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
연구는 세포 연구소와 Organismic 생물학에서 EM 코어와 학계 Sinica, 타이 페이, 대만의 곳을 알아내는-엠 코어에서 수행 했다. 작품은 학계 Sinica 및 대부분에 의해 지원 되었다.
Materials
| vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | Tissue sectioning |
| high-pressure freezer | Leica | EM HPM100 | Specimen preparation |
| freeze-substitution device | Leica | EM AFS2 | Specimen preparation |
| ultramicrotome | Leica | EM UC7 | Ultra-thin sectioning |
| dual-axis tomography holder | Fischione | Model 2040 | tomography collection |
| transmission electron microscope | FEI | Tecnai F20 | tomography collection |
| CCD | Gatan | UltraScan 1000 | tomography collection |
| Leginon | NRAMM/AMI | tomography collection | |
| IMOD | Boulder Laboratory for 3-D Electron Microscopy of Cells | Tomography reconstruction | |
| Avizo 3D | FEI | Tomography analysis | |
References
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