Mappatura simultanea e quantificazione di ribonucleotidi del DNA mitocondriale umano

questo protocollo è descritto nella Figura 1 e include l’isolamento di gDNA, digestione con enzimi di restrizione per essere in grado di quantificare il numero di ribonucleotidi, trattamento con alcali per idrolizzare fosfodiesterico di ribonucleotidi inglobato il gDNA, la fosforilazione delle estremità gratuito a 5 minuti-OH, ssDNA legatura delle schede, seconda sintesi di filo e l’amplificazione di PCR prima sequenziamento. 1. adattatori e indice primer ARC49 ottenere, oligonucleotidi ARC140, ARC76/77, adattatore e ARC78-ARC107 primer di indice (Vedi tabella 1). Nota: Oligonucleotidi devono essere purificato di HPLC. ARC76/77 sono ordinati come duplex. Soluzioni di riserva preparare 100 µM di ogni oligonucleotide in tampone Tris-EDTA (TE) (Vedi la Tabella materiali) e conservare a -20 ° C. Preparare 10 µM soluzioni di ARC67/77 e 2 µM di primer ARC49 e indice diluendo in tampone di eluizione (EB; si veda la Tabella materiali). Conservare a-20 ° C. 2. Crescita e raccolta di cellule cellule HeLa crescere in 70 mL Dulbecco ' s Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% siero bovino fetale in un matraccio di Spinner 250 mL a 37 ° C. Contare il numero di cellule e raccogliere 5 x 10 6 cellule in un tubo da 50 mL, centrifugare per 5 minuti a 200 x g e scartare il surnatante. Lavare le cellule con 20 mL 1X PBS, centrifugare per 5 minuti a 200 x g e scartare il surnatante. Congelare i pellet a-20 ° C o continuare con la purificazione del DNA. 3. Purificazione del DNA e la quantificazione purificare gDNA mediante estrazione del fenolo-cloroformio come descritto di seguito. Risospendere le cellule in 2 mL di tampone di lisi (Vedi la Tabella materiali) ed incubare per 30 min a 42 ° C su un blocco di riscaldamento. Attenzione: Il buffer di lisi contiene componenti pericolosi. Soluzione di SDS è irritante, proteinasi K sensibilizzanti, irritanti e tossici. Indossare indumenti protettivi e guanti. Dividere il campione in due provette da 2 mL e aggiungere 1 volume (V) di fenolo-cloroformio-alcool isoamilico (25:24:1). Attenzione: Fenolo-cloroformio-alcool isoamilico è tossico, mutageno, corrosivi e pericolosi per gli ambienti acquatici. Utilizzare in una cappa, indossare indumenti protettivi e guanti e gettare nei rifiuti speciali fenolo-cloroformio. Mix di inversione per 30-60 s e centrifugare per 5 min 15.000 x g a temperatura ambiente. Nota: Non non vortice DNA per evitare di introdurre le rotture del filo casuale, che falserebbero i risultati. Trasferire la fase acquosa superiore ad un nuovo tubo di 2 mL ed aggiungere 1 V di fenolo-cloroformio-alcool isoamilico (25:24:1). Mix di inversione e centrifugare per 5 min a 15.000 x g a 4 ° C. Trasferire la fase acquosa superiore per tubo un nuovo 2 mL e aggiungere 20 µ l NaCl (5 M) e isopropanolo freddo di 1 V. Attenzione: Isopropanolo è infiammabile, irritante e tossico. Conservarlo in un ventilato, indossare indumenti protettivi e guanti e tenere lontano da fiamme. Mix di inversione e incubare per almeno 1 h a -20 ° C. Centrifugare per 20 min 15.000 x g, 4 ° C e scartare surnatante. Pellet di DNA di lavaggio con etanolo 70% freddo 200 µ l, centrifugare per 20 min a 15.000 x g a 4 ° C ed eliminare il surnatante. Attenzione: etanolo al 70% è infiammabile e irritante. Tenere la soluzione di lavoro a-20 ° C, altrimenti negozio in ventilato, indossare indumenti protettivi e guanti e tenere lontano da fiamme. Asciugare il pellet di DNA a temperatura ambiente per 20-25 min. Pellet di DNA sciogliere in 100 µ l TE buffer e piscina i campioni in uno tubo. Concentrazione di DNA quantitate utilizzando un reagente di quantificazione di dsDNA secondo produttore ' s specifiche (Vedi la Tabella materiali). Nota: Utilizzare un reagente di quantificazione di dsDNA, perché spettrofotometrica quantificazione di DNA può essere influenzata da fenolo residua. Store DNA a-20 ° C o continuare con il trattamento di HincII. 4. Trattamento HincII e idrolisi alcalina mix Digest 1 µ g di DNA in una reazione contenente 5 µ l di tampone 10x 3.1, 1 µ l (10 U) HincII e privo di nucleasi H 2 O ad un volume finale di 50 µ l. Nota: Per ottenere le condizioni ottimali per la legatura, seconda sintesi di filo e l’amplificazione di PCR, esso può essere necessario aumentare la quantità di DNA input se si prevede che il DNA contiene un numero molto basso di ribonucleotidi. Allo stesso modo, può essere necessario diminuire l’ingresso del DNA se il numero di ribonucleotidi è molto alto. Incubare per 30 min a 37 ° C. HincII purificare trattati DNA con perline paramagnetici. Nota: Tenere il tubo coperchi aprire nei passaggi seguenti per non disturbare il pellet aprendo i tubi. Aggiungere 1,8 V di perline paramagnetici a ogni campione, mescolare accuratamente pipettando e incubare a temperatura ambiente per 10 min. Utilizzare un rack magnetico per pellet le perline per 5 min, poi rimuovere ed eliminare il surnatante. Lavare la pallina con 150 µ l di etanolo al 70% (temperatura ambiente) per circa 30 s quindi rimuovere e scartare il supernatante. Lavare la pallina con 200 µ l di etanolo al 70% (temperatura ambiente) per circa 30 s, quindi rimuovere e scartare il surnatante. Nota: Etanolo residuo può essere rimosso con una pipetta di 10 µ l. Le goccioline possono essere filate giù brevemente in anticipo. a secco i campioni a temperatura ambiente per circa 15-20 min. Nota: L’ora esatta dipende dal volume di perline e la forma del pellet, pertanto i pellet devono essere controllati visivamente. Rimuovere i tubi dal rack magnetico ed eluire pellet in 45 µ l EB, mix pipettando attentamente. Incubare per 5 minuti poi a pellet le perline sul rack magnetico e utilizzare 45 µ l di DNA purificato nel passaggio 4.4. Aggiungere 5 µ l di KOH (3 M) o KCl (3 M) per il creazione di un volume totale di 50 µ l di DNA. Attenzione: 3 soluzione di KOH M è corrosivo. Indossare indumenti protettivi e guanti. Forno Incubare per 2 ore a 55 ° C in un’ibridazione seguita da 5 min su Ice. Nota: Si raccomanda di eseguire il trattamento di KOH in un forno piuttosto che un blocco di riscaldamento per mantenere un riscaldamento uniforme del tubo ed evitare la condensa presso il coperchio. DNA precipitare aggiungendo 10 µ l di sodio acetato (3 M, pH = 5.2) e 125 µ l etanolo 100% freddo. Incubare in ghiaccio per 5 min. Attenzione: etanolo al 100% è infiammabile e irritante. Archiviare in un ventilato, indossare indumenti protettivi e guanti e tenere lontano da fiamme. Pellet gDNA mediante centrifugazione a 21.000 x g, 4 ° C per 5 min e scartare il surnatante. Pellet Wash DNA con 250 µ l freddo 70% EtOH, centrifugare a 21.000 x g, 4 ° C per 5 min e scartare il surnatante. Nota: Per rimuovere le goccioline, il tubo può essere filato giù brevemente nuovamente e surnatante può essere rimosso con una pipetta di 10 µ l. Asciugare il pellet in un tubo aperto per circa 5-10 minuti fino a quando tutto il liquido visibile evaporato. Si dissolve pellet di DNA lasciate in 20 µ l EB per 30 min a temperatura ambiente. 5. fosforilazione fine a 5 minuti preparare la miscela di reazione per ogni campione in anticipo controesistente di 2,5 µ l 10 x 2,5 µ l ATP (10 mM), 1 della chinasi di polinucleotide T4 di 3 ´-fosfatasi-minus µ l (10 U) e tampone di reazione della chinasi di polinucleotide T4. Trasferire 19 µ l di ogni DNA del campione in una nuova provetta da 200 µ l e denaturare per 3 min a 85 ° C in un termo-cycler. Cool DNA campioni su ghiaccio e aggiungere 6 µ l della miscela di reazione per ogni campione. Miscele di reazione Incubare a 37 ° C per 30 min e fermata la reazione incubando i campioni a 65 ° C per 20 min. Purificare il DNA come descritto al punto 4.3, utilizzando 1.8 V di perline paramagnetici ma eluire in 14 µ l EB. 6. ssDNA legatura preparare la miscela di reazione per ogni campione in anticipo composto da 0,5 µ l ATP (2 mM), 5 µ l 10 x tampone di reazione ligasi T4 RNA, 5 µ l CoCl 3 (NH 3) 6 (10 mM), 0,5 µ l ARC140 (100 µM) e 25 µ l 50% PEG 8000. Mix ben pipettando. Attenzione: CoCl 3 (NH 3) 6 è cancerogeno, sensibilizzanti e pericolosi per l’ambiente acquatico. Indossare indumenti protettivi e guanti. Trasferire 13 µ l di DNA purificato da 5.5 un passo ad un nuovo tubo di 200 µ l e denaturare per 3 min a 85 ° C in un termo-cycler. Raffreddare il DNA sul ghiaccio e 36 µ l di miscela di reazione per ogni campione, mescolare pipettando e spin giù brevemente. Aggiungere 1 µ l (10 U) di T4 RNA ligasi ad ogni reazione, Miscelare pipettando e spin giù brevemente. Incubare i campioni a temperatura ambiente nella notte scura. 7. Sintesi secondo-filo purificare legato del DNA come descritto al punto 4.3, ma utilizzare 0,8 V di perline paramagnetici, pellet le perline per 10 min ed eluire in 20 µ l EB. Nota: A causa della maggiore viscosità della miscela di reazione di legatura, il primo passo d’appallottolamento è prolungato. Trasferire 20 µ l di campione di DNA in una nuova provetta PCR 200 µ l. Ripetere il passaggio di purificazione mediante 0,8 V di paramagnetici perline seguendo il produttore ' s specifiche ed eluire in 14 µ l EB. Preparare il mix di reazione per ogni campione in anticipo che consiste di 2 µ l di tampone di reazione 10 di polimerasi del DNA del x T7, 2 µ l ARC76/77 (2 µM), 2 µ l dNTP (2 mM) e 0,8 µ l BSA (1 mg/mL). µ L trasferimento 12,8 purificato del DNA ad un nuovo tubo di 200 µ l, denaturare per 3 min a 85 ° C in un termo-cycler. Raffreddare il DNA sul ghiaccio e 6,8 µ l di miscela di reazione per ogni campione, mescolare pipettando, rallentare brevemente e incubare per 5 min a temperatura ambiente. 0,4 µ l (4 U) T7 DNA polimerasi in ogni reazione ed incubare per 5 min a temperatura ambiente. Purificare il DNA come descritto al punto 4.3, utilizzando 0,8 V di perline paramagnetiche ed eluire in 11 µ l EB. 8. L’amplificazione di PCR e la quantificazione di biblioteca tubo di preparare il mix di reazione per ogni campione in un nuovo 200 µ l in anticipo costituito da 7,5 µ l ARC49 (2 µM), 7,5 µ l indice primer (2 µM, unico per ogni campione) e 25 µ l 2 x avviamento a caldo miscela pronta. Aggiungere 10 µ l di campione di DNA per ogni reazione. Amplificare la libreria utilizzando le seguenti condizioni: denaturare a 95 ° C per 45 s, seguiti da 18 cicli di 98 ° C per 15 s, 65 ° C per 30 s, 72 ° C per 30 s, terminando con un allungamento finale a 72 ° C per 2 min. Hold campioni al 4 ° C dopo amplificazione. Purificare librerie come descritto al punto 4.3, utilizzando 0,8 V di perline paramagnetici ed eluire in 20 µ l di tampone TE. Quantitate librerie utilizzando un reagente di quantificazione di dsDNA, secondo il produttore ' s specifiche (Vedi la Tabella materiali). Conservare i campioni a-20 ° C o continuare con analisi biblioteca. 9. Analisi della libreria e Pooling determinano la qualità di ogni libreria e stimare la dimensione del frammento media utilizzando un sistema di elettroforesi digitale. Nota: La dimensione del frammento medio è valutato stimando dove l’area sotto la curva dell’elettroferogramma è dimezzato, trascurando le cime da marcatori. Risultati rappresentativi di profili adatti biblioteca dopo trattamento KOH o KCl sono riportati nella Figura 2A. Calcolare la concentrazione (nM) delle librerie come: /(p*650) (c/10 3)] * 10 9 dove c è la concentrazione della libreria in ng / µ l e p è la dimensione del frammento medio in bp, come valutato in 9.1. Piscina molare quantità uguali di fino a 24 biblioteche amplificati con gli iniettori di indice diverso per il sequenziamento. Aggiungere buffer di TE ad un volume finale di 25 µ l e alla concentrazione di 10 nM. Nota: A seconda del numero di librerie per eseguire il pooling, la quantità di DNA da ogni libreria è regolato. Se sono stati rilevati dimeri dell’iniettore nel passaggio 9.1 come un picco distinto di circa 130 bp, il volume finale della piscina biblioteca può superare 25 µ l, perché la fase di purificazione viene ripetuta come descritto al punto 4.3, utilizzando 0,8 V di perline paramagnetici, e DNA è eluito in 25 µ l TE buf Fer. Determinare la concentrazione di piscina biblioteca nuova utilizzando un reagente di quantificazione di dsDNA secondo produttore ' s specifiche e la media dimensione di picco come descritto sopra. Procedere al sequenziamento e analisi dei dati (articoli 10 e 11). 10. Sequenziamento eseguire sequenziamento accoppiato-fine 75-base su librerie pool 12. 11. analisi dei dati Trim tutte le letture per rimuovere sequenze adattatore, filtrare per qualità e leggere lunghezza. Nota: Questo può essere fatto utilizzando cutadapt 1.2.1 20 con il comando ‘ cutadapt -f fastq – incontro-lettura-i caratteri jolly – tranquillo -m 15 – q 10 – un NNNNNNN < FILE >’, dove NNNNNNN viene sostituito con la sequenza effettiva adattatore e < FILE > è sostituito con il nome del file fastq. Rimuovere accoppiamenti di letture che sono stati eliminati nel passaggio precedente utilizzando script personalizzati. Allineare Mate 1 dei restanti paia ad un indice contenente la sequenza di tutti gli oligonucleotidi utilizzati per la preparazione di biblioteca (ad es., utilizzando Bowtie 0.12.8 21 e la riga di comando Opzioni – m1-v2). Scarta tutte le coppie con successo allineamenti. Allineare coppie rimanenti al genoma di riferimento organismo utilizzando Bowtie con la riga di comando Opzioni – v2 -X 10000..–meglio. Mappa legge che spaziano tra la molecola mitocondriale inizio e fine allineando Mate 1 di tutte le coppie non allineate (utilizzando Bowtie con la riga di comando Opzioni – v2). Determinare il conteggio delle 5 ´-estremità per tutti gli allineamenti di fine singolo o coppia. Spostare la posizione di questi da una base a Monte sulla posizione dove erano l’idrolizzato ribonucleotidi. Esportazione dati dal file di bowtie formato in un formato di file di bedgraph utilizzando script personalizzati per la visualizzazione in comune browser genoma. Normalizzare le letture per ogni ciocca per letture al milione. Utilizzando i conteggi e la posizione del file di bedgraph, fare riferimento la sequenza del genoma di organismo per determinare l’identità di incorporated ribonucleotidi. Nota: Per il genoma mitocondriale umano si legge dalle regioni 16.200-300 e 5.747-5.847 per ogni filo dovrebbe essere esclusi dal momento che queste regioni contengono molti 5 ´-estremità libere non correlate all’incorporazione del ribonucleotide di DNA polimerasi γ. Dividere il totale letture, non tra cui letture a undici siti HincII, con il numero medio di letture al sito HincII per ottenere il numero di ribonucleotidi per rottura del singolo filo, (cioè il numero di ribonucleotidi per molecola mitocondriale).