Detecting the Lyme Disease Spirochete, <em>Borrelia Burgdorferi</em>, in Ticks Using Nested PCR

Melanie K. B. Wills; Andrea M. Kirby; Vett K. Lloyd

doi:10.3791/56471

JoVE Journal > Biology

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

生物学

الكشف عن مرض لايم Spirochete، البورليه Burgdorferi، في القراد باستخدام PCR متداخلة

Published: February 04, 2018

doi:

10.3791/56471

Melanie K. B. Wills¹, Andrea M. Kirby¹, Vett K. Lloyd¹

¹Department of Biology,Mount Allison University

Summary

يعشق [بكر] هو تقنية حساسة ومحددة وواضحة يمكن تطبيقها للتجزئة استخراج الحمض النووي للتحقيق البورليه burgdorferi، المسبّب لمرض لايم. التجربة الأولية PCR يستخدم الإشعال الخاصة بالجينات لتوليد أمبليكونس طويلة، ثم تصبح قوالب لفعل لاحقة باستخدام كبسولة تفجير الداخلية.

Abstract

مرض لايم هو عدوى المنقولة خطيرة بسبب الضيق البورليه burgdorferi أسرة لاتو اللولبية التي تنتقل إلى الإنسان عن طريق لدغة القراد Ixodes المصابة. أن عامل المسببة الأولية في أمريكا الشمالية معناها الضيق البورليه burgdorferi . توسيع مناطق المخاطر الجغرافية، فإنه من الحكمة لدعم برامج المراقبة القوية التي يمكن قياس معدلات الإصابة بالقراد وإبلاغ النتائج إلى الأطباء والأطباء البيطريين، وعامة الجمهور. تقنية جزيئية متداخلة البلمرة المتسلسل (نبكر) منذ فترة طويلة تستخدم لهذا الغرض، ويبقى اتباع نهج المركزية، وغير مكلفة والقوية في الكشف عن البورليه في القراد والحياة البرية.

يوضح هذا المقال تطبيق نبكر القراد مقتطفات الحمض النووي لتحديد العينات المصابة. دولتين مستقلتين بورجدورفيري باء- الأهداف، الجينات ترميز فلاجيلين ب (شحم) و بروتين السطح الخارجي A (القانوني)، وقد استخدمت على نطاق واسع مع هذا الأسلوب. البروتوكول يشمل جمع التجزئة، واستخراج الحمض النووي، ومن ثم إجراء جولة أولى من PCR للكشف عن كل من هذين البورليه-مواضع محددة. يستخدم اللاحقة البلمرة المتسلسل (PCR) المنتج من أول رد فعل كقالب جديد لتوليد شظايا التضخيم أصغر حجماً والداخلية. يحسن هذا النهج المتداخل على خصوصية وحساسية PCR التقليدية على حد سواء. ويعتبر علامة إيجابية بالنسبة لمسببات المرض عندما أمبليكونس الداخلية من كلا الجينات البورليه يمكن الكشف عنها بواسطة [اغروس] هلام التفريد.

Introduction

مرض لايم (LD) هو الأكثر شيوعاً العدوى المنقولة في نصف الكرة الشمالي، ويواصل انتشاره زيادة¹. بسبب هذا المرض الموهن مسببات الأمراض سبيروتشيتيل لايم borreliosis (رطل) معقدة (يشار إلى البورليه burgdorferi بالمعنى الواسع، أو س)، الذي يضم تاريخيا الممرض أمريكا الشمالية الغالبة، ب burgdorferi معناها الحرفي (ما)، بالإضافة إلى أفزيليي و جاريني باء، الذي يتم على نطاق واسع في جميع أنحاء أوروبا وآسيا، وهي الأنواع الناشئة أهمية سريرية²^،³. تنتقل هذه البكتيريا إلى الإنسان عن طريق لدغة القراد Ixodes المصابة². على الرغم من أن ناقلات أمريكا الشمالية الرئيسية هي سكابولاريس أولاً و باسيفيكوس أولاً، وجدت الأنواع متعددة داخل هذا جنس للمرفأ، ويحيل بكتيريا⁴. في البشر، ويمكن أن يسبب بورجدورفيري باء- إطار الأعراض التي تؤثر على الجلد، والمفاصل، والقلب والجهاز العصبي، الغدد الصماء، الجهاز الهضمي، والأجهزة الداخلية⁵^،^،من⁶⁷^، ⁸^،^،من⁹¹⁰. حاليا تقديرات مركز السيطرة على الأمراض والوقاية 300,000 أكثر حالات بشرية جديدة سنوياً في الولايات المتحدة¹¹^،¹². في حين غالباً ما التشخيص مواتية عند المرض يتم تشخيصه وعلاجه في المراحل المبكرة، اقترحت الدراسات في أي مكان بين 10 في المائة و 60 في المائة من المرضى الذين تلقوا نظام صادات الموصى بها التي ظلت تواجه الأعراض بعد العلاج وقف، في ظاهرة تسمى وظيفة علاج مرض لايم مرض (بتلدس)¹³^،^،من¹⁴¹⁵. وعلاوة على ذلك، التأخر في التدخل السريرية يمكن أن تنشأ نتيجة لنقص الوعي بلدغة القراد، العرض التقديمي غير محددة للمرض الأولى، وانخفاض حساسية التشخيص التقليدية المستندة إلى علم الأمصال عند استخدامها في بداية العدوى. فشل لعلاج سريع ومناسب يتيح تطور الأعراض التي يمكن أن تظهر في متزايد المنهكة مضاعفات¹⁶^،¹⁷. وللوقاية من مرض لايم حجر زاوية في إدارة المخاطر. استراتيجيات لمكافحة هذا التهديد المتزايد وتشمل تدابير المراقبة قوية تشير إلى أن انتشار الكائنات الممرضة في القراد، وتحديد المناطق الجغرافية من القلق.

يوضح هذا المقال فائدة متداخلة البلمرة المتسلسل (نبكر) كأداة فحص جزيئي بموجبه تحديد القراد المصابة. لزيادة الدقة، تستخدم اثنين من الجينات البورليه التضخيم موازية. فلاجيلين ب (شحم) يشفر بروتين خيوط رئيسية من السوط¹⁸، والجين الموجود على كروموسوم خطي واحدة، بينما المنتج بروتين دهني بروتين السطح الخارجي A (القانوني) يتوسط الأمامي القراد الاستعمار، وهو ترميز بلازميد¹⁹^،²⁰. يتكون سير العمل من مجموعة التجزئة، واستخراج الحمض النووي، ومن ثم إجراء جولة أولى من PCR للكشف عن البورليه-مواضع محددة. يستخدم PCR اللاحقة المنتج من أول رد فعل كقالب جديد لتوليد شظايا التضخيم أصغر حجماً والداخلية. يعتبر علامة إيجابية البورليه burgdorferi عندما أمبليكونس الداخلية من كلا الجينات البورليه يمكن الكشف عنها بواسطة [اغروس] هلام التفريد.

تقنية نبكر، و شحم وأهداف الجينات القانوني ، وقد استخدمت على نطاق واسع للمراقبة الإيكولوجية والكشف السريري ل spirochete لايم منذ أوائل التسعينات²¹^،^،من²²²³ ^،^،من²⁴²⁵. قبل وضع بروتوكولات الجزيئية، قيمت القراد بإخضاع محتويات القناة الهضمية لمضاداتالبورليه تلطيخ الفلورة (إذا كان) أو الثقافة الميكروبية، أو مزيج منها²⁶. هذه النهج تعاني من القيود الكامنة، بما في ذلك بطء النمو وطبيعة الحساسية البورليه²⁷وجسم مشاكل الأداء، وشرط القراد يعيش لحالة تجهيز²¹. بكر اعتمد لاحقاً تقديم تعريف الناقلة المصابة حساسة وسريعة ومحددة. أنه يوفر تحسينات ملحوظة على المنهجية التقليدية، بما في ذلك ثقافة مستقلة التطبيق المباشر لأنواع العينات المتنوعة، مثل القراد الميت والمؤرشفة التي لولا ذلك غير مناسب لاختبار²¹^،²². تصاميم تجريبية المتداخلة في مواصلة تحسين على خصوصية وحساسية PCR الكلاسيكية باستخدام مجموعتين متميزة من الإشعال الخاصة بالجينات في جولتين متتاليتين من التضخيم²⁵^،²⁸.

نجاح التجربة اعتماداً كبيرا على تصميم التحديد و amplicon الجينات الاستراتيجية. دقة تقدير وجود البورليه burgdorferi، كبسولة تفجير ينبغي الكشف عن مسببات الأمراض ذات الصلة دون كروسريكتينج بالحمى الراجعة اللولبية في جنس البورليه أيضا. في حالة شحم، وخصوصية هذا يتحقق من خلال استهداف منطقة داخلية متغير من الجينات، بدلاً من تسلسل ترافقه المصانة نسبيا التي يشترك فيها البكتيريا المتنوعة (الشكل 1)²⁴^،²⁹ ^, ³⁰.

رقم 1: مفهوم نبكر، كما هو موضح باستخدام البورليه شحم الجينات كهدف. تيرميني 5 ‘و 3’ الجينات شائعة للكائنات الحية خارج البورليه burgdorferi س. ل.، مما يجعل هذه المناطق غير مناسب لتقييم العوامل الممرضة المسببة لايم محددة. باستخدام تسلسل الداخلية التي حفظت أقل كأهداف التمهيدي، يتم تنفيذ جولتين من PCR للكشف عن أمبليكون النهائي، والداخلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

في اختبار قدرتها التمييزية، ويقيم ما يزيد على 80 يعزل البورليه مختلفة الداخلية شحم الإشعال، ووجدت لتحديد فقط تلك المرتبطة بمرض لايم²⁴. وقد تم توثيق الحد الأدنى للكشف نبكر في بين ستة²⁴ والبكتيريا³¹ عشرة من ثقافة نقية، على الرغم من أن يمكن زيادة تحسين الحساسية من النشاف في أمبليكون الجنوبية، والتهجين راديولابيليد أو التحقيق تشيميلومينيسسينت. اقتران التقنيات يقلل من عتبة الكشف إلى قرص واحد سبيروتشيتي³¹. بالمقارنة المباشرة، تم العثور على بكر واحد-الجولة التقليدية، أونبروبيد تقرير وجود حد أدنى من 10⁴ اللولبية³¹. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن أقل حساسية الفحص عند العمل مع العينات السريرية والبيئية المعقدة، نظراً لوجود الساحقة لا علاقة لها الحمض النووي والمواد المثبطة المحتملة. هذه التحديات يمكن التحايل عليها إلى حد كبير عن طريق استخدام نبكر.

وعلى الرغم من أوجه التقدم في التكنولوجيا الجزيئية في العقود الماضية، يظل نبكر تقنية التدبيس في جهود المراقبة الحديثة. إذا هو الحرص في تصميم وتنفيذ هذا البروتوكول، نهج قوية وقابلة للتكيف، وبسيط نسبيا لالتقاط وجود مسببات الأمراض في ناقلات التجزئة.

Protocol

1-الحمض النووي في معزل عن القراد الحصول على علامات التجزئة عن طريق الجمع الميداني، أو المراقبة السلبية من الأطباء البيطريين وأفراد الجمهور. ينبغي قتل بتجميد القراد، ووضعها في كيس مختوم، وترسل في درجة حرارة الغرفة. باستخدام نموذج الطلب، جمع المعلومات المتعلقة بالتاريخ والموقع الجغرافي للقاء، والتجزئة مرفق مركز الأنواع المضيفة، والأخيرة من تاريخ السفر من البلد المضيف. منذ PCR متداخلة أصلاً عرضه للتلوث، ضمان أن يتم إعداد مساحة العمل المختبري لتقليل التعرض عبر العينات. وهذا ينطوي على تنفيذ العناصر المختلفة للبروتوكول في مساحات منفصلة، مكرسة أيضا معزولة عن بعضها البعض تماما تنظيفها وتعقيمها، وضمان أن جميع الصكوك خالية من الملوثات. وعند استلام العينة، صورة القراد وتحديد الأنواع ومرحلة النمو والجنس وحالة تحفل بالمقارنة تعريف مفتاح32 . تحت ظروف معقمة، تقسم القراد باستخدام شفرة حلاقة العقيمة أو مشرط، ومكان الشظايا اثنين القراد في أنابيب ميكروسينتريفوجي منفصلة. لاستخراج الحمض النووي المجموع، استخدم أي إجراء العزل التي تسفر عن القالب المتوافق مع بكر؛ هذا البروتوكول يدل على نهج القائم على الخلبية بسيطة. ابدأ بإضافة بحجم مناسب (غالباً ما بين 50-200 ميليلتر) كاشف الخلبية الحال إلى الجزء القراد. المبلغ المحدد سوف تعتمد على حالة الحجم وتحفل العينة؛ المبادئ التوجيهية ينبغي أن توفرها الشركة المصنعة. مجانسة باستخدام مدقة microtube. احتضان عينات في حمام مائي عند 60 درجة مئوية 45 دقيقة، ودوامه بإيجاز. الطرد المركزي عينات لدقيقة 4 في 16,276 س ز (13,300 لفة في الدقيقة) في ميكروسينتريفوجي سطح مكتب. نقل المادة طافية microtube الطازجة، المسماة التي تحتوي على 50 ميليلتر الايزوبروبانول، مزيج من انعكاس، وإعادة الطرد المركزي كما هو الحال في (1.2.3). صب المادة طافية، وشطف بيليه الحمض النووي مع 50 ميليلتر من الإيثانول 70%. إزالة الزائدة الإيثانول مع ماصة، والسماح لبيليه أيردري لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ريسوسبيند الحمض النووي وإضافة 50 ميليلتر من 1 مم تريس pH 7.0، واحتضان عينات في حمام مائي ح 1 في 60 درجة مئوية. ويمكن الآن تخزين الحمض النووي في-20 درجة مئوية للتحليل الجزيئي في المستقبل. 2-كشف بكر البورليه القانوني و شحممتداخلة. ملاحظة: لمحة عامة بكر المبادئ والممارسات توفرها لورينز، 201233. توليف أو الحصول على البورليه اليغنوكليوتيد الخارجية والداخلية الخاصة بالجينات الإشعال. انظر الجدول 1 لمجموعات التمهيدي وأحجام أمبليكون كل منهما، ودرجات حرارة ذوبان. اسم الدليل الجينات المستهدفة تسلسل (5 ‘-3’) حجم أمبليكون درجة حرارة انلينغ شحم بمهاجم شحم جكاتكاكتتكاججتكتكا 503 بي بي 55 درجة مئوية شحم خارج Rv شحم تجججاكتجاتاجككتج شحم في مهاجم شحم كتتاجاجتكاتجتجاج 447 bp 58 درجة مئوية شحم في Rv شحم تكاتجككاتجكاجاتجت مهاجم خارج القانوني القانوني كتجاجتتتكااجاجات 487 bp 55 درجة مئوية رف خارج القانوني القانوني كاكتجكتجاككككتكتات القانوني في مهاجم القانوني أكاجاجكاجاكجاككاج 350 شركة بريتيش بتروليوم 58 درجة مئوية القانوني في Rv القانوني تجتجككاتتجاجتكجتا الجدول 1: كبسولة تفجير الداخلي والخارجي نبكر البورليه بورجدورفيريفلاب والقانوني.في الواقع، كشف كبسولة تفجير شحم بورجدورفيري ب س. س. والآخر ارتباطاً وثيقا جينوسبيسيس البورليه ، بينما الإشعال القانوني التقاط فقط بورجدورفيري س. س. تشير إلى التضخيم من كلا المكاني باء burgdorferi. س. س. قبل تعقيم خزانة PCR مع الأشعة فوق البنفسجية من الضوء و 70% من الإيثانول.ملاحظة: لتقليل التلوث المحتملة بعينه، ينبغي أن تكون مميزة من موقع تشريح القراد، استخراج الحمض النووي، وهلام التفريد مساحة العمل هذه. لتشغيل بكر الأولى، استخدام الإشعال الخارجي بالتزامن مع قالب الحمض النووي استرداد في الخطوة 1، 0 أعلاه، وإعداد رد فعل الخليط كما هو موضح في الجدول 2. في موازاة ذلك، أداء إيجابيا يعمل التحكم تتألف من التحقق من البورليه الحمض النووي، وتشغيل المراقبة السلبية بما في ذلك ردود الفعل لا قالب للكشف عن التلوث الكاشف والهباء الجوي. إضافة الحمض النووي في النهاية إلى تقليل التلوث المحتملة من الكواشف. ضمان كل أنبوبة مغلقة في جميع الأوقات عندما لا يتم إضافة الكواشف وإغلاق الأنابيب فورا بعد إضافة الحمض النووي، وقبل أن يتم فتح أنابيب أخرى. برنامج cycler حرارية النحو التالي: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ دورات 40 من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، الصلب درجة الحرارة لمدة 30 ق، 72 درجة مئوية ل 45 s؛ 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ وعقد في 4 درجات مئوية. إجراء الجولة الثانية من PCR مشابهة لأول رد فعل، فيما عدا استخدام كبسولة تفجير الداخلية مع 2 ميليلتر من أول منتج PCR (المنتجة في 2.2.2).ملاحظة: حجم رد الفعل مرة أخرى ترد في الجدول 2. ويجب الحرص على تجنب التلوث عبر من أمبليكونس بضمان أن تتم إضافة الحمض النووي قالب آخر وأن أنابيب فقط تناظر عينة واحدة مفتوحة في وقت واحد. المكون بكر # 1 وحدات التخزين بكر # 2 وحدات التخزين بوليميراز ماجستير بوليميريز ميكس 2 X ميليلتر 12.5 ميليلتر 12.5 المياه خالية من نوكلاس ميليلتر 8.5 ميليلتر 8.5 10 ميكرومتر كبسولة تفجير للأمام وعكس الإشعال الخارجي ميليلتر 1.0 كبسولة تفجير داخلية ميليلتر 1.0 قالب الحمض النووي ميليلتر 2.0، من استخراج عينة (1.2.7) ميليلتر 2.0، من جولة 1 من بكر (2.2.2) الجدول 2: بكر خليط من رد فعل لإيضاحات مسهبة الأولى والثانية. برنامج cycler الحرارية كما كان من قبل، ولكن ضبط درجة الحرارة انلينغ لاستيعاب الإشعال الداخلية (انظر الجدول 1). 3-[اغروس] هلام التفريد والتصوير ملاحظة: للحصول على الإرشادات الأساسية حول فصل الحمض النووي بالتفريد، راجع لي et al., 201234. إعداد 1.2% [اغروس] هلام استخدام 20 “س س” العازلة (0.2 M هيدروكسيد الصوديوم، 0.8 متر الماء المقطر pH 8)، يخفف إلى 1 X، وإضافة حوالي 5 ميليلتر من وصمة الحمض النووي، قبل سكب، إذا قبل تلطيخ جل هو المطلوب. تحميل 10 ميليلتر للمنتج من رد فعل بكر (الداخلية) الثانية من كل التجريبية ونموذج عنصر تحكم، جنبا إلى جنب مع سلم bp 100 (5 ميليلتر). اليكتروفوريسي على ح 1 107 الخامس (5 فولت/سم). عرض وتوثيق الجل باستخدام ترانسيلوميناتور والكاميرا المرتبطة بها والبرمجيات.

Representative Results

نبكر نهج أنيقة لزيادة خصوصية وحساسية للكشف عن مسببات الأمراض، لا سيما عندما يجري التحقيق في العينات البيئية المعقدة. كما هو مبين في الشكل 1، جولتين من PCR استهداف منطقة استراتيجية موضع شحم البورليه (و القانوني، لا في الصورة) يمكن تقرير وجود البكتيريا البورليه burgdorferi من خلال توليد الداخلية قصيرة أمبليكونس. عندما تحل بالتفريد هلام، نواتج التفاعل شحم و القانوني من كل علامة يمكن بصريا وسجل ومقارنته مع عناصر التحكم. في الشكل 2، تتوفر معرفات فريدة من نوعها العينة على طول الجزء العلوي من كل جيل، ولا-قالب والهباء الجوي يتم تمثيل عناصر التحكم في أقصى اليسار واليمين، على التوالي، المتاخمة للسلالم. عصابات أمبليكون قوية تتجلى بوضوح في تحديد العينات التجريبية، وتمييزها بسهولة من كبسولة تفجير الفائض والمتبقي الحمض النووي (الشكل 2). استناداً إلى مبادئ التصميم التجريبي، علامة تعتبر إيجابية البورليه عندما موازية إثبات عناصر سلبية لا التضخيم، وتنتج أمبليكونس الداخلية من الإشعال شحم و القانوني على حد سواء. وفي هذه الحالة، اجتمع العينات T907 و T604 و T606 معايير المراقبة لمسببات المرض لايم (الشكل 2). By contrast، لم يكن إلا T923 الإيجابية القانوني، نتيجة التي توجد عدة تفسيرات محتملة: A) القراد المنشأ كان سلبيا بالنسبة البورليه، ولكن إعداد PCR القانوني الخارجي أو الداخلي أيامهم كانت ملوثة قالب الحمض النووي (علما بأن التلوث المنهجي من الكواشف استبعد عبر عناصر سلبية)، ب) القراد لايم البورليه، ولكن كميات منخفضة من قالب أو خطأ تجريبي منعت التضخيم من شحمأو ج) كائن حي كان حاضرا التي الواردة في التسلسل القانوني مصانة، ولكن تفتقر إلى فلاجيلين أو كانت الهوية غير كافية في المنطقة المستهدفة من شحم يصلب لكبسولة تفجير. وفي الواقع، لوحظت التشابه التسلسل القانوني في مجموعة متنوعة من الكائنات الحية، بما في ذلك النباتات والحيوانات28. الحالة العكسية، تضخيم الأكثر حفظت فلاجيلين الجينات، ولكن ليس الجين القانوني ، يمكن الإشارة إلى أنواع البورليه ذات صلة. في الممارسة العملية، هذا البروتوكول تعطي نتائج إيجابية واحدة القانوني أكثر من القيام بالاشعال شحم ، مما يوحي بأن السيناريو ‘A’ هو التفسير الأقل احتمالاً. دون مزيد من التحليل التجريبي للعينة المثيرة للجدل، ومع ذلك، من غير الممكن تحديد المصدر بنتيجة إيجابية واحدة. قد تساعد زيادة عدد replicates التقنية التي أجريت على عينات ملتبسة للتوفيق بين وضعهم الحقيقي، إذ لن يكون أي الملوثات التي أدخلت أيامهم إلى ردود الفعل السابقة الموجودة في الحمض النووي المؤرشفة. بيد إذا كانت التفاعلات اللاحقة مع هذه الإشعال لا توفر نتائج قاطعة، المكاني البورليه أخرى يمكن التحقيق في PCR. يمكن أيضا تعيين تسلسل أمبليكونس المتولدة من ردود الفعل هذه ومقارنة بين يعزل للمساعدة في تعيين الهوية، وتقدير درجة الاختلاف سلالة. Sapi والزملاء تقديم مثال لسير العمل هذا باستخدام العينات السريرية البشرية35. اعتبار جميع العوامل، معايير البروتوكول والتفسير المبين قد قدرت أن تحقق معدلات سلبية إيجابية وكاذبة كاذبة 0.17 في المائة و 0.0063 في المائة، على التوالي. الشكل 2 : الكشف عن البورليه burgdorferi في القراد الفردية التي نبكر من شحم و القانوني- يتم تمثيل الرموز المعينة إلى كل التجزئة عبر الجزء العلوي من المواد الهلامية، والهويات محاذاتها عمودياً تقرير كشف القانوني و شحم في كل عينة. الممرات المعنون ب إلى يسار عناصر التحكم في قالب لا تمثل الصورة، بينما الضوابط الهباء الجوي للقبض على تلوث البيئة مختبر (ممرات يد اليمنى). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

على مدى عقود الاستخدام، أثبتت التقنيات المستندة إلى بكر ثبات قيمتها في الكشف عن البورليه من العينات المفصلية والثدييات، سواء البورليه تأتي من أصول بيئية أو السريرية. بكر يقدم العديد من التحسينات على نهج موجود مسبقاً للمراقبة. جدير بالذكر أن لا يعتمد على تطوير وأداء الكواشف الأجسام المضادة، وبدلاً من ذلك يمكن بسهولة تكييفها للكشف عن أهداف جديدة للاهتمام ببساطة عن طريق تعديل تسلسل التمهيدي. بكر يستوعب أيضا تقييم مواقع متعددة في نفس الوقت، أما بصورة مستقلة أو عن طريق فعل متعدد. يمكن تطبيقها على المدخلات العينة المتنوعة، بما في ذلك القراد الطازجة والمحفوظة في الأرشيف²²والحيوان أو سوائل الجسم البشري والأنسجة مستأصل²⁵. كما غلة بكر أمبليكونس التي يمكن معالجتها بالمزيد، على سبيل المثال بهضم إنزيم التقييد أو التهجين مسبار أو التسلسل، زيادة التبصير الهوية الميكروبية²¹.

كأداة سريرية، بكر الأفضل نظرياً إلى تشخيص المصلية القياسية، كما أنها توفر إشارة مباشرة لوجود البكتيريا، بدلاً من الاعتماد على الاستجابة المناعية المضيف كتدبير ثانوي للإصابة. بيد بوريليوسيس لايم يرتبط بعبء الميكروبية متواضعة نسبيا (< الكائنات 50/مل من البول أو البلازما) والنتائج سبيروتشيتيميا عابرة، الذي يمكن أن يؤدي إلى سلبية زائفة²⁵. حساسية هذا الأسلوب في العيادة يختلف اختلافاً كبيرا تبعاً لنوع النسيج، المرحلة من العدوى، والشرط عينة، التي تقع بين 12.5% و 62% في الدراسات الحالية للدم والسائل النخاعي، وفحص الأنسجة³⁶. حساسية الجزيئية القيود ليست مصدر قلق إذا PCR يجري بعد ثقافة البكتيرية، بيد أن استعادة اللولبية قابلة للاستمرار من العينات السريرية أثبتت كذلك تحديا. إلا في الآونة الأخيرة قد تم تحسين البروتوكولات لأعلى غلة³⁵. وفي الوقت نفسه، القناة الهضمية التجزئة الكبار المصابين يمكن إيواء في المتوسط في أي مكان من 000 2 إلى أكثر 50,000 البورليه³⁷^،³⁸^،³⁹، وقوة داخل نطاق الكشف نبكر. وهكذا، البروتوكول مناسبة تماما لجهود المراقبة القراد.

وعلى الرغم من مزاياها العديدة، نبكر تطرح بعض التحديات، وقدرة هذه التقنية على تقرير دقيق الإصابة بالقراد ولذلك تعتمد على التحديد الاستراتيجي للجينات وأمبليكونس، ومهام سير العمل التجريبية الدقيقة التي استرداد نوعية الحمض النووي من العينات مع تقليل التعرض عبر العينات، واستخدام عناصر التحكم المناسبة التي يمكن تقرير الملوثات في البيئة المختبرات والمواد الكاشفة. قبل أي التجريب، نطاق والنوايا للتحقيق ينبغي تحديد بوضوح حتى أن المكاني الوراثية المناسبة، ومناطق فيها، يمكن تحديدها. إذا كان الهدف توفير على شاشة غير منحازة س يسبب لايم البورليه burgdorferi المعقدة، ينبغي إنشاء كبسولة تفجير للكشف عن كافة سلالات المقترنة مع تقارب مماثل وكفاءة التضخيم، دون التقاط لا علاقة لها ²⁵من الكائنات الحية. يمكن تصميم كبسولة تفجير جديدة والمقررة في السيليكون باستخدام أدوات البرمجيات مثل انفجار التمهيدي⁴⁰، على الرغم من أنها ينبغي أيضا التحقق من صحة تجريبيا ضد مرجعية معيارية يعزل قبل تطبيقه على عينات أونتشاراكتيريزيد. والهدف من هذا الإجراء استخراج الحمض النووي لاسترداد قالب الميكروبية سليمة من عينة بيئية مختلطة (علامة هوموجيناتي). خطوة اختيارية قبل المتابعة مع بكر لتقييم سلامة الحمض النووي المستخرج. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إعداد ردود أفعال موازية لاستهداف جين التدبير المنزلي في القراد. الأسلوب الأخير يمكن أن تشير أيضا إلى وجود مثبطات في خليط رد فعل، توفير زيادة الثقة بأن ردود الفعل السلبية البورليه نظراً لغياب الكائن الحي، وعدم وجود ملوث المثبطة.

زيادة الحساسية للنهج PCR متداخلة يأتي على حساب تلوث محتمل أن يولد نتائج إيجابية كاذبة. يمكن إدخال قالب خارجية بعينه أثناء تشريح القراد والانتعاش الحمض النووي، أو عملية إعداد ردود فعل التضخيم الخارجي والداخلي. ولذلك المهم خصوصا لاتباع أفضل الممارسات بروتوكولات لبكر لتجنب قالب أو amplicon التلوث المتبادل. هذه تشمل استخدام محطات عمل منفصلة مع أيرفلووس المستقلة، والاحتواء في بكر وخزانات السلامة البيولوجية، حسب الاقتضاء، شاملة الكيميائية والفيزيائية تنظيف وتعقيم الأسطح والمواد الكاشفة، والتعامل مع الحذر من الحمض النووي⁴¹-عناصر القالب لا أيضا حيوية في تحديد تلوث كواشف الأسهم. مشكلة عدم حصانة خاصة نبكر amplicon المناولة التي تحدث عند نقل المنتجات من أول رد فعل في السفينة PCR الثانية. منذ الهدف الحمض النووي وقد خضع بالفعل تخصيب الأسى في عينات إيجابية، هذه الخطوة لا سيما المعرضة للتلوث عبر، وقد تم وضع بروتوكول نبكر أنبوب واحد للالتفاف حول هذا القيد. في هذا النهج، يتم إضافة مجموعتي كبسولة تفجير لجين معين معا إلى أنبوب رد فعل التي تظل مختومة لكل جولات PCR³¹. يجب أن تكون أزواج التمهيدي الخارجي والداخلي [ثرمودنميكلي] مميزة، مثل أن الزوجين الخارجي يضاعف القالب عند درجة حرارة انلينغ عالية باهظة للإشعال الداخلية. في الجولة الثانية، هو خفض درجة الحرارة انلينغ لاستيعاب الزوج الداخلية. ليس فقط هل هذا تجاوز خطوة يحتمل الخلط، ويسمح أيضا استخدام إضافية تدابير مكافحة التلوث³¹^،⁴². إلا أن هذا التعديل قد التضحية ببعض الحساسية المقايسة. بغض النظر عن النهج، زيادة عدد replicates التقنية التي تجري بشكل مستقل على عينة سوف يساعد على تحديد التلوث زائفة.

ظلت تتطور منذ إدخال نبكر التقنيات الجزيئية، وهذه النهج الجديدة توفر مزايا تحديد أكثر التصاميم الأصلية، أن كان ذلك في زيادة المصروفات المالية. وكما يوحي اسمها، PCR الكمي (الوقت الحقيقي أو qPCR (RT)-PCR) يسمح لتعداد الكائنات الممرضة في عينة، بينما نوعي في طبيعة⁴³التقنيات التقليدية. حساسية قبكر يشبه يقال أن نبكر³⁸، على الرغم من أنه يمكن أن تتقلب تبعاً للخصائص التمهيدي²⁸. كما أظهرت تباين qPCR يستخدم منارات الجزيئية (ميغابايت) بدلاً من التقليدية تكمان المسابير الوعد في الكشف عن البورليه في العينات السريرية⁴⁴^،^،من⁴⁵⁴⁶. بسبب هيكلها الثانوي فريدة من نوعها، إنتاج منارات الجزيئية يقال أن أقل الخلفية الفلورية وإشارات شرعية أعلى، مما يوفر حساسية فائقة⁴⁷. توحي التقييمات قبل السريرية عتبة كشف محتملة بين واحد وعشرة اللولبية⁴⁴^،⁴⁵. وعلاوة على ذلك، التقنية قد طبقت بنجاح في التفاعلات المتعددة في نفس الوقت كشف جينات مضيف الثدييات⁴⁴ والأخرى المسببة للأمراض التي ينقلها القراد⁴⁵، وما لا يمكن تحقيقه سهولة مع نبكر. وتشمل تعديلات التصميم الأخرى الحبرية بكر (دبكر) التكنولوجيا الرقمية، التي يمكن تحديدها كمياً الحمض النووي دون استخدام³⁹^،المنحنى المعياري⁴⁸. الحد الأدنى للكشف عن هذا الأسلوب البورليه بالمثل نحو عشر عينة اللولبية/³⁹. مقارنة نبكر، هذه النهج قد أيضا استفادة إمكانات المخفضة للتلوث، كما أنها تتطلب فقط بروتوكول واحد تضخيم.

إذا كان هدف المراقبة بدلاً من ذلك على التشكيل الجانبي محتويات علامة البكتيرية المتنوعة، هو فحص الجينومية الرنا الريباسي 16S خياراً جذاباً⁴⁹. على الرغم من أن هذا النهج هو أكثر تكلفة ويتطلب التعاقب الحمض النووي المتخصصة غير موجودة في جميع مختبرات البيولوجيا الجزيئية ويقتضي التفسير القائم على المعلوماتية الحيوية أكثر تطورا، فإنه يمكن التقاط مجموعة واسعة من الجراثيم لأكثر دقة ويمثل الحمل الممرض ناقل.

بينما قبكر ومشتقاته أساليب الاختيار للتطبيقات الكمية، وشاشات metagenomics توفر مخزونات واسعة من ميكروبيومي التجزئة، جهود المراقبة المستهدفة غالباً ما تعني بثنائي الإبلاغ عن وجود أو عدم وجود عوامل ممرضة واحدة أو عدد قليل في ناقل. في ظل هذه الظروف، قد يعرض هذه النهج أحدث وأكثر تفصيلاً تعقيد لا لزوم لها والعبء المالي في العملية. ولهذه الأسباب، قد نبكر صمدت لاختبارات الزمن كأسلوب رئيسي في تجزئة الاختبار.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

الكتاب نود أن نشكر هاريس كامي للتصميم التمهيدي، أشلي ماكيبون وجيسيكا توماس-أبيت للتصوير، وجون بلاكلي، ألكسندرا فولي-أبي، كريس ﻻنغلي، لويس جولي، ماكنتاير كيلسي، أشلي ماكيبون، الله كريس وروزي الكلب للظهور في فيديو. أ. م. ك. تدعمها “المؤسسة الكندية لأبحاث مرض لايم”، وتم توفير التمويل مشروع العلوم الطبيعية والهندسة بحوث المجلس من كندا (مقدمة). م. ك. ب دبليو تلقي راتب التمويل من مؤسسة نيو برونزويك الابتكار (نبيف).

Materials

LabGard Class II, Type A2 biological safety cabinet	Nuaire	ES AIR NU-543
Razor blades	VWR	55411-050	0.22 mm thickness
Microfuge Tubes (Microtubes 1.5 mL)	Axygen	311-08-051
AquaGenomic	MultiTarget Pharmaceuticals	2030	DNA extraction reagent
Microtube Pestle	Diamed	DIATEC610-1551	Designed for 1.5 ml tubes
Water bath – Isotemp 202	Fishse Scientific	15-462-2
Vortex	Labnet	S0100 CAN
Spectrafuge 24D Digital Microcentrifuge	Labnet	C2400
Isopropanol	Sigma-Aldrich	190764
BIS-TRIS	Sigma-Aldrich	B9754
Primer Synthesis	Sigma-Aldrich	OLIGO
PCR Cabinet	Misonix	PCR6-482
PCR tube with attached flat caps 0.2mL	VWR	20170-012
GoTaq Green Master Mix 2x	Promega	M7123
Nuclease-free water	Promega	M7123	The water comes with the GTG
Spectrafuge Mini	Labnet	C1301
SYBR Safe DNA Stain 10,000X Concentration	EDVOTEK	608
Froggarose LE (Molecular Biology Grade Agarose)	FroggaBio	A87-500G
GD 100 bp DNA Ladder	FroggaBio	DM001-R500
Electrophoresis power pack	VWR	VWR 105	EC Apparatus Corporation
Fluor-S MultiImager	BioRad	170-7700 (Serial number 433B0154)
Quantity One 1-D Analysis Software (V. 4.5.2)	BioRad	1709600

References

Schotthoefer, A. M., Frost, H. M. Ecology and epidemiology of Lyme borreliosis. Clin. Lab. Med. 35 (4), 723-743 (2015).
Franke, J., Hildebrandt, A., Dorn, W. Exploring gaps in our knowledge on Lyme borreliosis spirochaetes – Updates on complex heterogeneity, ecology, and pathogenicity. Ticks Tick Borne Dis. 4 (1-2), 11-25 (2013).
Rudenko, N., Golovchenko, M., Vancova, M., Clark, K., Grubhoffer, L., Oliver, J. H. Isolation of live Borrelia burgdorferi sensu lato spirochaetes from patients with undefined disorders and symptoms not typical for Lyme borreliosis. Clin. Microbiol. Infect. 22 (3), 267.e9-267.e15 (2016).
Scott, J. D., Clark, K. L., Anderson, J. F., Foley, J. E., Young, M. R., Durden, L. A. Lyme Disease Bacterium, Borrelia burgdorferi Sensu Lato, Detected in Multiple Tick Species at Species at Kenora, Ontario, Canada. J Bacteriol Parasitol. 08 (01), 1-10 (2017).
Sperling, J., Middelveen, M., Klein, D., Sperling, F. Evolving perspectives on lyme borreliosis in Canada. Open Neurol J. 6, 94-103 (2012).
Pachner, A. R. Early disseminated Lyme disease: Lyme meningitis. Am. J. Med. 98 (Supplement 1), 30S-43S (1995).
Mikkilä, H. O., Seppälä, I. J., Viljanen, M. K., Peltomaa, M. P., Karma, A. The expanding clinical spectrum of ocular lyme borreliosis. Ophthalmology. 107 (3), 581-587 (2000).
Mc Causland, F. R., Niedermaier, S., Bijol, V., Rennke, H. G., Choi, M. E., Forman, J. P. Lyme disease-associated glomerulonephritis. Nephrol. Dial. Transplant. 26 (9), 3054-3056 (2011).
Tunev, S. S., Hastey, C. J., Hodzic, E., Feng, S., Barthold, S. W., Baumgarth, N. Lymphoadenopathy during Lyme Borreliosis Is Caused by Spirochete Migration-Induced Specific B Cell Activation. PLoS Pathog. 7 (5), e1002066-e1002014 (2011).
Kostić, T., et al. Manifestations of Lyme carditis. Int. J. Cardiol. 232, 24-32 (2017).
Hinckley, A. F., et al. Lyme Disease Testing by Large Commercial Laboratories in the United States. Clin. Infect. Dis. 59 (5), 676-681 (2014).
Nelson, C. A., et al. Incidence of Clinician-Diagnosed Lyme Disease, United States 2005-2010. Emerg. Infect. Dis. 21 (9), 1625-1631 (2015).
Aucott, J. N., Rebman, A. W., Crowder, L. A., Kortte, K. B. Post-treatment Lyme disease syndrome symptomatology and the impact on life functioning: is there something here?. Qual Life Res. 22 (1), 75-84 (2012).
Aucott, J. N., Crowder, L. A., Kortte, K. B. Development of a foundation for a case definition of post-treatment Lyme disease syndrome. Int. J. Infect. Dis. 17 (6), e443-e449 (2013).
Adrion, E. R., Aucott, J., Lemke, K. W., Weiner, J. P. Health care costs, utilization and patterns of care following Lyme disease. PLoS ONE. , (2015).
Cameron, D. J. Consequences of treatment delay in Lyme disease. Journal of Evaluation in Clinical Practice. 13 (3), 470-472 (2007).
Johnson, L., Aylward, A., Stricker, R. B. Healthcare access and burden of care for patients with Lyme disease: a large United States survey. Health policy. 102 (1), 64-71 (2011).
Motaleb, M. A., et al. Borrelia burgdorferi periplasmic flagella have both skeletal and motility functions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (20), 10899-10904 (2000).
Rosa, P. A., Tilly, K., Stewart, P. E. The burgeoning molecular genetics of the Lyme disease spirochaete. Nat. Rev. Microbiol. 3 (2), 129-143 (2005).
Kenedy, M. R., Lenhart, T. R., Akins, D. R. The role of Borrelia burgdorferi outer surface proteins. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 66 (1), 1-19 (2012).
Persing, D. H., Telford, S. R., Spielman, A., Barthold, S. W. Detection of Borrelia burgdorferi infection in Ixodes dammini ticks with the polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 28 (3), 566-572 (1990).
Persing, D. H., et al. Detection of Borrelia burgdorferi DNA in museum specimens of Ixodes dammini ticks. Science. 249 (4975), 1420-1423 (1990).
Wise, D. J., Weaver, T. L. Detection of the Lyme disease bacterium, Borrelia burgdorferi, by using the polymerase chain reaction and a nonradioisotopic gene probe. J. Clin. Microbiol. 29 (7), 1523-1526 (1991).
Johnson, B. J., Happ, C. M., Mayer, L. W., Piesman, J. Detection of Borrelia burgdorferi in ticks by species-specific amplification of the flagellin gene. Am. J. Trop. Med. Hyg. 47 (6), 730-741 (1992).
Schmidt, B. L. PCR in laboratory diagnosis of human Borrelia burgdorferi infections. Clin. Microbiol. Rev. 10 (1), 185-201 (1997).
Ogden, N. H., et al. Ixodes scapularis ticks collected by passive surveillance in Canada: analysis of geographic distribution and infection with Lyme borreliosis agent Borrelia burgdorferi. J. Med. Entomol. 43 (3), 600-609 (2006).
Doern, G. V. Detection of selected fastidious bacteria. Clin. Infect. Dis. 30 (1), 166-173 (2000).
Nolte, O. Nucleic Acid Amplification Based Diagnostic of Lyme (Neuro-)borreliosis – Lost in the Jungle of Methods, Targets, and Assays?. Open Neurol J. 6 (1), 129-139 (2012).
Wallich, R., Moter, S. E., Simon, M. M., Ebnet, K., Heiberger, A., Kramer, M. D. The Borrelia burgdorferi flagellum-associated 41-kilodalton antigen (flagellin): molecular cloning, expression, and amplification of the gene. Infect. Immun. 58 (6), 1711-1719 (1990).
Picken, R. N. Polymerase chain reaction primers and probes derived from flagellin gene sequences for specific detection of the agents of Lyme disease and North American relapsing fever. J. Clin. Microbiol. 30 (1), 99-114 (1992).
Picken, M. M., Picken, R. N., Han, D., Cheng, Y., Strle, F. Single-tube nested polymerase chain reaction assay based on flagellin gene sequences for detection ofBorrelia burgdorferi sensu lato. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 15 (6), 489-498 (1996).
Keirans, J. E., Litwak, T. R. Pictorial key to the adults of hard ticks, family Ixodidae (Ixodida: Ixodoidea), east of the Mississippi River. J. Med. Entomol. 26 (5), 435-448 (1989).
Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
Sapi, E., Pabbati, N., Datar, A., Davies, E. M., Rattelle, A., Kuo, B. A. Improved culture conditions for the growth and detection of Borrelia from human serum. Int J Med Sci. 10 (4), 362-376 (2013).
Waddell, L. A., Greig, J., Mascarenhas, M., Harding, S., Lindsay, R., Ogden, N. The Accuracy of Diagnostic Tests for Lyme Disease in Humans, A Systematic Review and Meta-Analysis of North American Research. PLoS ONE. 11 (12), e0168613-e0168623 (2016).
Brunet, L. R., Spielman, A., Telford, S. R. Density of Lyme disease spirochetes within deer ticks collected from zoonotic sites. Am. J. Trop. Med. Hyg. 53 (3), 300-302 (1995).
Wang, G., et al. Real-time PCR for simultaneous detection and quantification of Borrelia burgdorferi in field-collected Ixodes scapularis ticks from the Northeastern United States. Appl. Environ. Microbiol. 69 (8), 4561-4565 (2003).
King, J. L., Smith, A. D., Mitchell, E. A., Allen, M. S. Validation of droplet digital PCR for the detection and absolute quantification of Borrelia DNA in Ixodes scapularis ticks. Parasitology. 144 (4), 359-367 (2017).
Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13 (1), 134 (2012).
Kwok, S., Higuchi, R. Avoiding false positives with PCR. Nature. 339 (6221), 237-238 (1989).
Rys, P. N., Persing, D. H. Preventing false positives: quantitative evaluation of three protocols for inactivation of polymerase chain reaction amplification products. J. Clin. Microbiol. 31 (9), 2356-2360 (1993).
Pahl, A., Kühlbrandt, U., Brune, K., Röllinghoff, M., Gessner, A. Quantitative detection of Borrelia burgdorferi by real-time PCR. J. Clin. Microbiol. 37 (6), 1958-1963 (1999).
Saidac, D. S., Marras, S. A. E., Parveen, N. Detection and quantification of Lyme spirochetes using sensitive and specific molecular beacon probes. BMC Microbiol. 9 (1), 43 (2009).
Chan, K., Marras, S. A. E., Parveen, N. Sensitive multiplex PCR assay to differentiate Lyme spirochetes and emerging pathogens Anaplasma phagocytophilum and Babesia microti. BMC Microbiol. 13 (1), 295 (2013).
Schlachter, S., Chan, K., Marras, S. A. E., Parveen, N. Detection and Differentiation of Lyme Spirochetes and Other Tick-Borne Pathogens from Blood Using Real-Time PCR with Molecular Beacons. Methods Mol. Biol. 1616, 155-170 (2017).
Wang, L., Blasic, J. R., Holden, M. J., Pires, R. Sensitivity comparison of real-time PCR probe designs on a model DNA plasmid. Anal. Biochem. 344 (2), 257-265 (2005).
Sze, M. A., Abbasi, M., Hogg, J. C., Sin, D. D. A Comparison between Droplet Digital and Quantitative PCR in the Analysis of Bacterial 16S Load in Lung Tissue Samples from Control and COPD GOLD 2. PLos ONE. 9 (10), e110351-e110356 (2014).
Sperling, J. L., et al. Comparison of bacterial 16S rRNA variable regions for microbiome surveys of ticks. Ticks Tick Borne Dis. , 1-9 (2017).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Wills, M. K. B., Kirby, A. M., Lloyd, V. K. Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR. J. Vis. Exp. (132), e56471, doi:10.3791/56471 (2018).