יחידנית או משולבת הדמיה גישה המבוססת על מיקרו-CT וקרינה פלואורסצנטית טומוגרפיה מולקולרית להערכת האורך של ריאות הנגרמת Bleomycin פיברוזיס בעכברים
Summary
אנו מתארים הדמיה גישה המבוססת על מיקרו-CT וקרינה פלואורסצנטית טומוגרפיה מולקולרית להערכת האורך של המודל פיברוזיס הריאות העכבר המושרה על ידי החדרה intratracheal כפול של bleomycin יחידנית או פולשני משולבת.
Abstract
Idiopathic פיברוזיס ריאתי (IPF) היא מחלת ריאות קטלנית המאופיינת על ידי הרס הריאה אדריכלות, אשר גורם משמעותי להידרדרות תפקודי ריאה ומוות עוקבות של כשל נשימתי הדרגתיים ובלתי הפיכים.
בפתוגנזה של IPF במודלים חייתיים ניסיוני יש נגרמו bleomycin המינהל. במחקר זה, אנו לחקור מודל עכבר דמוי-IPF המושרה על ידי החדרה bleomycin intratracheal זוגי. הערכות היסטולוגית סטנדרטי עבור פיברוזיס של הריאה הם הליכים פולשניים מסוף. מטרת עבודה זו היא לעקוב אחר פיברוזיס של הריאה באמצעות טכניקות הדמיה לא פולשנית כגון טומוגרפיה מולקולרית פלורסנט (FMT), מיקרו-טי אלה שתי טכנולוגיות חוקיותו עם היסטולוגיה ממצאים יכול לייצג מהפכנית פונקציונלי ניטור בזמן אמת לא פולשנית של חומרת המחלה IPF והתקדמות. היתוך גרעיני של גישות שונות מייצג צעד נוסף להבנת המחלה משקפות את עמדות, שבו ניתן לראות את האירועים המולקולריים המתרחשים במצב פתולוגי עם FMT ו ניתן לנטר שינויים אנטומיים הבאים על ידי מיקרו-טי
Introduction
Idiopathic פיברוזיס ריאתי (IPF) היא מחלת ריאות כרונית עם ירידה הדרגתית של פונקציות ריאות כי היא למרבה הצער לעיתים קרובות קטלנית תוך 4 שנים מיום אבחון1. התכונות הגדולות של IPF מטריצה חוץ-תאית התצהיר והתפשטות פיברובלסט, אך בפתוגנזה אינה כבר מובנת במלואה. ההיפותזה נתמכת ביותר הוא כי מספר מחזורים של פציעות בריאות לגרום להרס של תאים אפיתל מכתשי שמוביל שינוי של התפשטות mesenchymal מחזור התא, הצטברות מוגזמת של fibroblasts, myofibroblasts, ו ייצור מוגבר מטריקס. מתווכים המעורבים בתהליכים אלה כגון מטריקס metalloproteinases (MMPs) התגלו dysregulated בפיתוח פיברוזיס IPF אנושי או במודלים חייתיים bleomycin-induced. ההפקה MMP לא מבוקרת מוביל התצהיר קולגן לא מאוזנת בתוך הריאות interstitium ואת שטח מכתשי, מחקה את הפצע חריג תיקון1,2.
אחד המכשולים העיקריים גילוי תרופות ופיתוח הוא הזמינות של מודלים העכבר נגיש המחקים הפתוגנזה אנושי ו פנוטיפ של המחלה. סוכנים שונים שימשו לזירוז פיברוזיס של הריאה במודלים של בעלי חיים: הקרנה נזק, הניהול של אסבסט, סיליקה, מנהלה של ציטוקינים fibrinogenic ו-3,bleomycin4; אולם bleomycin ביותר בשימוש עכברים, עכברושים, שרקנים, אוגרים, ארנבות5 או6,חיות גדולות (פרימטים לא אנושי, סוסים, כלבים ומעלי גירה)7. Bleomycin היא אנטיביוטיקה שנעשו על ידי החיידק Streptomyces verticillus8 ומשמש בתור סוכן אנטי סרטניים9. פיברוזיס ריאתי היא תופעת לוואי נפוצה של הסם ומסיבה זו, הוא משמש במודלים חייתיים ניסיוני לזירוז לייפת.
במודלים פיברוזיס ריאות הנגרמת bleomycin, נגעים שהותירה להתרחש 14-21 יום לאחר bleomycin המינהל. עבודה שהוצגו, השתמשנו פרוטוקול חדש לזירוז פיברוזיס של הריאה בעכברים על ידי החדרה intratracheal bleomycin כפול. המודל העכבר bleomycin הוא מאוד זמן רב כי תרופות חדשות צורך להעריך על נגעים שהותירה הוקמה, ונבדק לבידול והשפעותיהם anti-fibrotic השפעות אנטי דלקתיות.
נחישות הביוכימי של קולגן תוכן, morphometrical וניתוח היסטולוגית התבססו על ניתוח פוסט מורטם, הגבלת האפשרות לעקוב בפתוגנזה של המחלה אותה חיה. אף על פי הפרמטרים הללו נחשבו תקן הזהב להערכה פיברוזיס, הם לא לספק כל הפצה הזמנית או המרחבי של הנגע שהותירה וגם למנוע דרך לחקור את התהליך של התקדמות המחלה. 10
לאחרונה, טכנולוגיות הדמיה לא פולשנית הוחלו על צג שיפוץ דרכי הנשימה, דלקת, פיברוזיס התקדמות במודלים מאתר: דימות תהודה מגנטית (MRI), מיקרו מחשב טומוגרפיה (מיקרו-CT), קרינה פלואורסצנטית מולקולרית טומוגרפיה (FMT) וזוהרים (רבנות בלי)11,12,13,14,15,16,17,18,19 20, ,21. אנו מציעים גישה הדמיה לא פולשנית לנטר longitudinally ריאות פיברוזיס על ידי התקדמות FMT ו- Micro-CT בנקודות שונות בזמן-לאחר bleomycin אתגר22.
משעולים רבים מעורבים הקמה ופיתוח של פיברוזיס, לא הרבה ידוע. רק הבנה מעמיקה יותר של תהליכים אלה יכול לתרגם עוד סמים מטרות זה רשאי להעביר לתוך המרפאה. היכולת לנטר MMP ההפעלה longitudinally על-ידי קרינה פלואורסצנטית טומוגרפיה מולקולרית מצמידים זיהוי שינויים parenchymal הריאה על ידי מיקרו-CT עשויה לשמש בעתיד כדי לגשת התגובה הקלינית לטיפול.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות הרבה קבוצות מחקר המתמקד בפיתוח תרופות חדשות לטיפול IPF, כרגע רק שניים זמינים עבור חולים. יש צורך רפואי דחוף למצוא טיפולים יעילים יותר7 כי עד כדי כך הישרדות של 4-5 שנים26רק ריאות transplantationis. תנאי מוקדם חיוני translational רפואה ופיתוח של תרופות חדשות היא הזמינות של מודל ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להודות ד ר דניאלה Pompilio, רוברטה Ciccimarra לקבלת עזרה טכנית.
Materials
| FMT 2500 Fluorescence Tomography System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| MMPsense 680 | Perkin Elmer Inc. | NEV10126 | Protect from light, store the probe at 4 °C |
| TrueQuant software | Perkin Elmer Inc. | ||
| Female inbred C57BL/6 | San Pietro NatisoneHorst, The Netherlands (UD), | Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions | |
| Isoflurane | ESTEVE spa | 571329.8 | Do not inhale |
| Automated cell counter | Dasit XT 1800J | Experimental Builder | |
| Saline Solution, 0.9% Sodium Chloride (NaCl) | Eurospital | 15A2807 | |
| Quantum FX Micro-CT scanner | Perkin Elmer Inc. | ||
| Bleomycin sulphate from Streptomyces Verticillus | Sigma | B2434 | |
| Automatic tissue Processor | ATP700 Histo-Line Laboratories | ATP700 | |
| Embedding system | EG 1160 Leica Biosystems | EG 1160 | |
| Rotary microtome | Slee Cut 6062 | ||
| Digital slide scanner | NanoZoomer S60, Hamamatsu Photonics | ||
| NIS-AR image analysis software | Nikon | ||
| Masson’s Trichrome Staining | Histo-Line Laboratories | ||
| 10% neutral-buffered formalin | Sigma | HT5012-1CS | |
| Penn-century model DP-4M Dry power insufflator | Penn-century | DPM-EXT | |
| PE190 micro medical tubing | 2biological instruments snc | BB31695-PE/8 | |
| Syringe without needle 5 mL | Terumo | SS*05SE1 | Cut the boards of the piston by scissors |
| Hamilton 0.10 mL (model 1710) | Gastight | 81022 | |
| Discofix 3-way Stopcock | Braun | 4095111 | |
| Syringe with needle 1 mL | Pic solution | 3,071,260,300,320 | Use without needle |
| Plastic feeding tubes 18 ga x 50 mm | 2biological instruments snc | FTP-18-50 | Cut obliquely the tip |
References
- Wynn, T. A. Integrating mechanisms of pulmonary fibrosis. J. Exp. Med. 208 (7), 1339-1350 (2011).
- Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nat. Med. 18 (7), 1028-1040 (2012).
- Moore, B. B. Animal models of fibrotic lung disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (2), 167-179 (2013).
- Ackermann, M., et al. Effects of nintedanib on the microvascular architecture in a lung fibrosis model. Angiogenesis. , (2017).
- Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294 (2), 152-160 (2008).
- Organ, L., et al. A novel segmental challenge model for bleomycin-induced pulmonary fibrosis in sheep. Exp Lung Res. 41 (3), 115-134 (2015).
- Organ, L., et al. Structural and functional correlations in a large animal model of bleomycin-induced pulmonary fibrosis. BMC Pulm Med. 15, 81 (2015).
- Shen, B., Du, L., Sanchez, C., Edwards, D. J., Chen, M., Murrell, J. M. Cloning and characterization of the bleomycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces verticillus ATCC15003. J Nat Prod. 65 (3), 422-431 (2002).
- Yu, Z., et al. Targeted Delivery of Bleomycin: A Comprehensive Anticancer Review. Curr Cancer Drug Targets. 16 (6), 509-521 (2016).
- Ashcroft, T., Simpson, J. M., Timbrell, V. Simple method of estimating severity of pulmonary fibrosis on a numerical scale. J Clin Pathol. 41 (4), 467-470 (1988).
- Stellari, F., et al. In vivo imaging of the lung inflammatory response to Pseudomonas aeruginosa and its modulation by azithromycin. J Transl Med. 13, 251 (2015).
- Stellari, F., et al. In vivo monitoring of lung inflammation in CFTR-deficient mice. J Transl Med. 14 (1), 226 (2016).
- Stellari, F. F., et al. In vivo imaging of transiently transgenized mice with a bovine interleukin 8 (CXCL8) promoter/luciferase reporter construct. PloS one. 7 (6), 39716 (2012).
- Stellari, F. F., et al. Enlightened Mannhemia haemolytica lung inflammation in bovinized mice. Vet Res. 45, 8 (2014).
- Tassali, N., et al. MR imaging, targeting and characterization of pulmonary fibrosis using intra-tracheal administration of gadolinium-based nanoparticles. Contrast Media Mol Imaging. 11 (5), 396-404 (2016).
- Ma, X., et al. Assessment of asthmatic inflammation using hybrid fluorescence molecular tomography-x-ray computed tomography. J Biomed Opt. 21 (1), 15009 (2016).
- Van de Velde, G., et al. Longitudinal micro-CT provides biomarkers of lung disease that can be used to assess the effect of therapy in preclinical mouse models, and reveal compensatory changes in lung volume. Dis Model Mech. 9 (1), 91-98 (2016).
- Stellari, F. F., et al. Heterologous Matrix Metalloproteinase Gene Promoter Activity Allows In Vivo Real-time Imaging of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Transiently Transgenized Mice. Front Immunol. 8, 199 (2017).
- Hellbach, K., et al. X-ray dark-field radiography facilitates the diagnosis of pulmonary fibrosis in a mouse model. Sci Rep. 7 (1), 340 (2017).
- Zhou, Y., et al. Noninvasive imaging of experimental lung fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 53 (1), 8-13 (2015).
- Ruscitti, F., et al. Longitudinal assessment of bleomycin-induced lung fibrosis by Micro-CT correlates with histological evaluation in mice. Multidiscip Respir Med. 12, 8 (2017).
- Stellari, F., et al. Monitoring inflammation and airway remodeling by fluorescence molecular tomography in a chronic asthma model. J Transl Med. 13, 336 (2015).
- . . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th ed. , (2011).
- Meganck, J. A., Liu, B. Dosimetry in Micro-computed Tomography: a Review of the Measurement Methods, Impacts, and Characterization of the Quantum GX Imaging System. Mol Imaging Biol. , (2016).
- Hubner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples). BioTechniques. 44 (4), 507-514 (2008).
- King, T. E., Pardo, A., Selman, M. Idiopathic pulmonary fibrosis. Lancet. 378 (9807), 1949-1961 (2011).
- De Langhe, E., et al. Quantification of lung fibrosis and emphysema in mice using automated micro-computed tomography. PloS one. 7 (8), 43123 (2012).
