Compensação de toda a montagem e coloração de Siliques e órgãos de flor de Arabidopsis

Flores estão entre os mais importantes definindo órgãos das angiospérmicas. Plantas apareceu há alguns anos 90 milhões¹e diversificou-se tão rápido que sua rápida aparição foi descrita como um “abominável mistério” por Charles Darwin². Os interesses dos investigadores da planta em desenvolvimento da flor são diversos. Algumas pesquisas centrou-se na compreensão da origem evolutiva da flor como um todo, ou a evolução das propriedades específicas de anatômicas, estruturais e funcionais de flores^3,4,5,6 . A alta variação na forma floral e estrutura, bem como os modos de reprodução sexual e assexual, confiando neles, fazer a flor de uma estrutura altamente complexa. Isto levou a diversos esforços para caracterizar as anatomia e características estruturais dos órgãos florais, usando técnicas de microscópica luz e o elétron que poderiam ser combinadas com investigações genéticas e moleculares⁷. Além disso, como a fonte de frutos e sementes, as flores são de suma importância para a nutrição humana e animal. Portanto, a caracterização de desenvolvimento de flores e frutas tem muitas implicações para a investigação aplicada, incluindo a segurança alimentar de uma população humana crescente e estratégias de conservação ecológica sob uma mudança de ambiente^{8 , 9 , 10}.

Desenvolvimento da flor em Arabidopsis começa com indução de flor e a transformação do meristema vegetativa para uma meristema de inflorescência (grupo de flores). Primordia flor é iniciada lateralmente no flanco do meristema inflorescência¹¹. O primordia órgão floral forma progressivamente em espirais concêntricos de fora para o centro da flor e eventualmente evoluir para sépalas, pétalas, estames e carpelos⁷. Estes órgãos florais cumprir distinta nutritiva, protetora e funcional (por exemplo, atração de polinizadores) funções em diferentes espécies de plantas, com os órgãos sexuais, sustentando o desenvolvimento de gametófitos masculinos e femininos, respectivamente,^{12 , 13}. os gametófitos, por sua vez, cada diferenciam um par do sexo masculino (esperma) e gametas femininas (ovo e célula central), que unem a dupla fertilização para formar a próxima geração, o zigoto e o endosperma primário, um terminal tecido apoiando o desenvolvimento do embrião^14,15. Desenvolvimento de frutos e sementes apoiar o crescimento, maturação e preservação do embrião e, eventualmente, a sua dispersão. Extensas pesquisas tem sido realizada para caracterizar o desenvolvimento de flor e embrião em espécies de plantas diversas, especialmente nas espécies modelo Arabidopsis^7,16,17.

Primeiras análises microscópicas de desenvolvimento da flor basearam-se na observação técnicas, tais como a parafina ou resina incorporação e seccionamento, combinado com a luz ou microscopia eletrônica e processamento de amostra demorada. Estas técnicas microscópicas tradicionais eram frequentemente usadas em combinação com as investigações de genéticas moleculares, tais como análises microscópica de mutantes, a localização do RNA por hibridação in situ ou imuno-detecção de proteínas. Recentes progressos em microscopia de fluorescência de campo amplo e confocal, no estado-da-arte em 3D auxiliado por computador imagem análises e o contínuo refinamento dos métodos moleculares que podem ser usados em espécimes de toda a montagem minimamente processados, levou a uma necessidade de técnicas de processamento eficiente e mínimo de amostra que são preferencialmente passíveis de análises quantitativas. Nos últimos anos, tem sido feitos progressos significativos no desenvolvimento de técnicas de compensação em toda a montagem espécime animal. Eles processam a amostra transparente usando reagentes aquosa ou açúcar-à base de ureia (por exemplo, escala, SeeDB, cúbicos)^18,19,20, ou removendo seletivamente lipídios (usando o detergente SDS) após incorporação de amostras em hidrogel estável; a remoção de lipídios pode ser alcançado por difusão passiva (por exemplo, modificação clareza protocolo²¹, pacto-PARS-aros²²) ou ativamente por eletroforese (original clareza protocolo²³ e PRESTO ACT²⁴). Encorajado por este progresso rápido, também estão surgindo algumas técnicas derivadas para uso em plantas.

Este papel de métodos focado no modelo Arabidopsis, descrevemos o procedimento para a adequada dissecção de botões florais, flores e siliques jovens e a limpeza de toda a montagem amostras para coloração diversa e procedimentos de observação usando clássica ou um recente método de compensação baseada em SDS. Exemplos de amido, callose e mancha de cromatina são dadas. Embora esses procedimentos podem precisar de mais melhorias e adaptações quando usado com outras espécies, esperamos que irão definir o cenário para uma pesquisa mais adicional sobre esses métodos simples, mas essenciais que são o ponto de partida de muitos projetos de pesquisa.