マンナン ペースを用いた植物細胞壁多糖の構造解析

1 です。 植物材料の収穫 新鮮な植物材料 (~ 20 mg) を収穫しすぐに 96% (v/v) エタノールで水没と 70 の ° C で 30 分間インキュベート; 任意の細胞壁分解酵素の存在を非アクティブ化します。乾燥した材料、手順 2 で開始します 。 注意: エタノールは可燃性 。 注: 単一の幹またはロゼット葉は分析のための十分な材料を提供します。ただし、エラーの少ない発生組織の大きい量をプールし、これは重量を量りやすく処理を分析する場合。 は慎重に組織型を記録し、両方によって異なります多糖類の構造と発達段階。たとえば、シロイヌナズナ (ここで使用されて) とステージ ボイズ ら の方法に従って組織 15 注: このプロトコル使用している花房内の茎の下半分、最初の silique は完全に細長い黄変しないが、。 2 準備のアルコール不溶性残渣 (空気) モーティマー ら の方法に従って、空気の準備。 9 またはデンプンおよびショ糖などの糖を欠けている粉を作り出すために、別の同じような方法です。 3。早かったと空気前処理 注: 正確な各サンプルは、(a) (b) によりキチンオリゴ糖の平均サイズと材料に関心の多糖類の豊かさに依存するために必要な空気量GH。オリゴ糖の数は実験の感度を決定しますので、メソッドは単一蛍光分子をそれぞれオリゴ糖の還元末端に追加します。ガイドラインとしてシロイヌナズナ幹 GH5 ・ GH26 (前述)、消化でグルコマンナン 500 μ g お勧め 11 GH11 と消化されるシロイヌナズナ幹のキシラン、100 μ g モーティマーのように勧めに対し ' s 研究 3。 15 mL 遠心チューブに空気 (10-15 mg) の重量を量ると H 2 O 最終濃度 2 mg/mL のを追加します。渦もサスペンションを達成するために。これが問題になる場合は、このプロセスを支援するためにガラスのホモジナイザーを使用して。。 および microfuge に分注 500 μ g チューブ。真空遠心分離機を使用して因数を乾燥 (材料の表 を参照してください) 一晩 30 ° C 1 M NaOH で前治療空気 (20 μ L) 部屋の温度で 1 時間これは多糖類を脱アセチルし、うねりセルロースミクロフィブリル、バイオマス構造を崩すことや GH アクセス 。 注: この手順は、精製された多糖類をスキップできます。注意 – 強い酸/塩基。 No 酵素航空管制の因数が含まれます (手順 4.1 を除く、すべてのサンプルと同じ扱われますは除外)。。 追加 200 μ H 2 O と 20 μ L 1 M 塩酸を中和します。テストの pH は 6 ~ 7 を 1 μ L を採取して pH インジケーター短冊にスポッティングします。 追加 50 μ L 1 M アンモニウム酢酸緩衝液、pH 6.0 (またはいずれかの pH は GHs における使用のために適切) と H 2 O 500 μ L の総ボリュームを与えるにします 。 注: 乾燥時にのこしたこと、およびサンプルを追加塩を加えないので、酢酸アンモニウムが使用されます。塩の過剰はペースのゲルの悪いバンド形と解像度につながることができます。 4。糖加水分解酵素 (GHs) が付いている空気の加水分解 注: の説明で述べたように、GHs の純度が重要です。のみを使用してクローンを表明、アフィニ ティー精製酵素です。メーカーから各ロットの受領、一晩 GH の量を増やすことによる基板 (例えば 500 μ g 空気) の定義の因数分解 (例えば 0.5、1、2、5、10、15、20 μ L) (3 単位/μ L)。GH の過剰がある、ペース指紋が同一になります。酵素の過剰は、それは加水分解反応の終点が近づいていることを特定する必要がありますので、再現性のある結果を提供する必要です。 追加ステップ 3.5 からバッファーに空気採取するマンナナーゼ (GH26 GH5 11) として正の前もって決定された量 (上で見なさい) コントロール (こんにゃくグルコマンナンの 30 μ g)、および no AIR 負コントロール (酵素ミックス、空管)。渦と簡単に管の下で反応混合物を収集するために、スピンします。 穏やかな撹拌 (~ 100 rpm) で 37 ° C (または選択の GH の適切な温度) で一晩インキュベートします。 は、95 ° C で 20 分間のインキュベーションで反応を停止 注: キャップの閉鎖は、フリップ トップ microfuge の管を密封する使用できます。 最大速度でベンチ トップおよび microfuge を使用して、10 分間遠心し、上清を保持します。 250 μ L H 2 O は、上記のように、遠心分離機でペレットを再懸濁します、上澄みを保持します。 両方の培養上清を組み合わせるし、真空遠心分離で乾燥 (材料表 参照) 30 ° c (~ 3 h または加熱しなくても一晩). 5。オリゴ糖基準の作成 H 2 O mannopentaose (男 5)、mannotetraose (4) mannotriose (3) mannobiose (2) マンノース (男) の 準備 1 mM 在庫ソリューション、mannohexaose (男 6)、すべて β、1-4 リンクします。因数と-20 ° c まで必要なストア。 1 μ L (標準的な S1)、2 μ L (S2) を組み合わせることにより男の濃度の異なる 3 1 6 混合物を準備またはすべての六つの 5 μ L (S3). 真空遠心分離で乾燥 (材料表 参照) 30 ° c (~ 1 h). 6。オリゴ糖 Derivitization H 2 O で 0.2 M アリ (8-Aminonaphthalene-1,3,6-トリスルホン酸) の貯蔵液の準備: 酢酸 17:3。60 ° C を完全に固体を溶解する温かみのある在庫があります。-20 ° c、2-3 か月の光から保護されたストア。 は、DMSO 中 2-ピコリン ボラン (2 PB) の 0.2 M ストック溶液を調製します。吸湿性がきわめて高い、だからすぐに DMSO で受信時にすべての粉体を再懸濁します。因数と 1-2 年の-20 ° C でストア。必要 (2 週間とし、破棄のための 4 ° C でストア) として因数を解凍。 H 2 O の誘導体化バッファーを準備: 酢酸酸: DMSO 17:3:20 します。 それぞれのサンプル、アリ、誘導体化バッファーの 2 PB、10 μ L の 5 μ L の 5 μ L を追加するには、。チューブの底に収集するために簡単にスピン渦徹底的にして再度簡潔に回転し。反応の説明の 図 1 を参照してください。 37 ° C、光から保護で一晩加温サンプル。 真空遠心分離で乾燥 (材料表 参照) 30 ° c (~ 2 h). 再懸濁します サンプルと 100 μ L の 3 M の尿素の標準。-20 ° c、必要になるまでの光から保護されたストア。 7。ペースの作製ゲル 注: ゲル鋳造装置のアセンブリはブランドによって異なります。ここでは、私たち use 垂直電気泳動システム スペーサー 18 × 24 cm ガラス板と 1.5 mm 装備 (材料の表 を参照してください). 、メーカーごとのゲル鋳造装置を組み立てる ' s 指示します。 次のように を 10 倍ペース バッファー (1 M トリス-ホウ酸、pH 8.2): H 2 O と解散するミックスの ~ 400 mL にトリス ベースの 121.14 g を追加。固体ホウ素酸 (約 60 g) の添加により 8.2 に pH を調整し、最大 1 ボリューム ・ l ・ H 2 o. 因数で 10% (w/v) アンモニウムの過硫酸 (APS) 株式を作ると-20 ° C 雪解け因数で一度保存、4 ° C で保存し、2 週間後破棄します。 を作るし、解決のゲルを注ぎなさい。上記の機器を 50 mL 1 ゲルを同一視します。50 mL の遠心管 H 2 O (20.2 mL) 5 mL 10 倍ペース バッファー 24.6 mL 40% アクリルアミド/ビス-アクリルアミド (29:1 acrylamide:Bis) をミックスします。(注意: 有毒). は APS の 200 μ L と N, N, N, N´-テトラメチル-エチレンジアミン (TEMED) の 20 μ L を追加。(気泡を導入することを避けるため) にミックスを軽く反転します。血清学的を使用してゲルまたは他大量ピペット、〜 4 cm ガラス板の上端を注ぐ。気泡ゲルの中に閉じ込め取得の可能性に注意を払います。かどうか彼らは、注いで、停止、チルト/タップそれらを解放するゲル。 イソプロパノール (注意 : 可燃性) や、慎重に、H 2 O を許可する (20-30 分) を重合し、最上位のレイヤーを離れて注ぎゲル ゲルをオーバーレイします。あぶらとり紙を使用して余分な液体洗浄 H 2 o ・ ドライで 2 倍、イソプロパノールを使用した場合です。 を作るし、スタッキングのゲルを注ぎなさい。ミックス 6.8 mL H 2 O、1 mL 10 倍ペース バッファー、2.8 mL アクリルアミド/ビス-アクリルアミド (注意: 毒性)、80 μ L の AP と 15 mL 遠心管中の TEMED 8 μ L。ミックスする反転し、重合解決のゲルの上にオーバーレイします。櫛歯の下でトラップ空気の泡を避け、櫛をそっと挿入します。 (20-30 分) を重合する 許可するゲルは湿った組織で、プラスチック製のラップをラップし、必要になるまで 4 ° C で保存します。場所に櫛を使用してストア 。 注: ゲル ペースに対して格納できる最大 2 週間 (1 週間以内が理想的です) が、湿った、保管される場合。 8。ペースを実行しているゲル 永久的なマーカーを使用して、読み込み順序を追跡するのに役立つ、ガラスによく位置にラベルを付けるし、識別するのに井戸が櫛を取り外したら。 は、櫛を削除します。1 x ペース バッファーで井戸を埋める。 では、10 μ L, マイクロシリンジを使用して井戸に 2 μ L の標準およびサンプルを読み込みます。一番外側のレーンは、不十分なサンプルを実行する傾向があるを使用しないでください。 ゲル実行装置の上部チャンバーを組み立てるし、冷却 (~ 10 ° C) 実行中戦車 (10 ° C) でジェル 1 x ペース バッファーを含みます。1 x ペース バッファーと上部チャンバーします。 および有効に電源と 200 V でゲルの実行 (定数 V) 30 分、その後、増加電圧 1000 V を 1 時間 40 分。(例えば、 黒いゴミ袋のタンクをラップすること) の光からゲルを保護します 。 注: 電圧をオンとし、別の 5 分後に 1000 V に電圧を増加した後ゲル 〜 5 分を確認します。場合は、パワーパックはバッファー リークがある可能性が高い電圧を維持することができます。タンクからゲルを削除します。慎重にすべてのガスケットの配置をチェック上部の部屋を再度連結します。ガラス板の上部の端に大規模なチップは、ガスケットに良好なシールを形成する板を防ぐことができます。これ通常一時的に解決できる上部チャンバーを追加する前に、ガラスの欠けの部分に 5% (w/v) 溶融 agarose のドロップを追加しています。 9。ペース ゲルを視覚化する 注: 長波長紫外線電球、transilluminator、蛍光体、ここ 530 nm に適しているカメラの発光フィルターを搭載したシステムをイメージング ゲルを使用します。また、レーザー スキャナーも使用できます、Goubet 2 で説明した。 イメージング システム ゲル湿った糸くず組織とそれを拭くことによってフリー塵であるを確認します。 ペース タンクからゲルを削除し、ながらゲルはまだガラス板を簡単に表示 (< 80 ms) 染料フロントがゲルでまだ判断する。 ウェッジ ツールを使用してゲルを開きながら、ゲルがまだ 1 つのガラス プレート上にスタッキングのゲルの両方を削除するピザ カッターを使用し、ゲル、ゲルの底上色素の前面にある場合。 は、transilluminator の表面に 〜 5 mL H 2 O を入れ、transilluminator に直接ゲルを転送します。UV 605 にフィルターを設定し、長波長 UV transilluminator をオンに (材料の表 を参照してください) ソフトウェアを使用しています 。 注: ここで使用されるアリ fluorophore は 353/520 の励起・発光 nm。 は様々 な露光時間でいくつかの画像を取る (例えば、 100 ms を 10 s)。紫外線は蛍光性の低下を避けるため (オフに) する UV ライト] ボタンをクリックして画像のオフになってことを確認します。画像の少なくとも 2 には飽和のバンド (ゲルのイメージング ソフトウェアはこれを示している) がないようにします。 高 resolution.tif 画像としてファイルを保存します 。 注: 画像は、イメージング システム、ゲルまたは ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) など、自由に利用できる画像分析ソフトウェアを使用して、付属のソフトウェアを使用して分析できます。定量の議論の 結果 を参照してください。