Структурные характеристики Маннан полисахаридов клеточной стенки в растений с использованием ПАСЕ

1. заготовки растительного материала урожай свежего растительного сырья (~ 20 мг) и сразу погружаться в 96% (v/v) этанола и Инкубируйте на 70 ° C за 30 мин; это отключает любой клеточной стенки, унижающего достоинство ферменты настоящего. Для сухого материала, начать с шага 2. Предупреждение: Этанол является легковоспламеняемым. Примечание: Один стебель или розетка листьев будет предоставлять достаточно материала для анализа. Однако, меньше ошибок возникают, если объединяются и проанализированы, поскольку это легче весят и обрабатывать большее количество ткани. Тщательно записывать ткани типа и стадии развития, как полисахарида структура изменяется с обоими. Например с Arabidopsis thaliana (используется здесь), этап ткани согласно методы из Бойс и др. 15 Примечание: В настоящем Протоколе, мы использовали в нижней части стебля соцветия, где первый стручок полностью вытянута но не желтеет. 2. Подготовка спирт нерастворимых остатков (воздуха) подготовка воздуха, следующий после метода Мортимер и др. 9 или другого аналогичного метода, для того чтобы произвести порошок не хватает растворимых сахаров, например сахароза и крахмал. 3. Aliquoting и предварительной очистки воздуха Примечание: точное количество воздуха, необходимого для каждого образца будет зависеть () обилие полисахарид интерес в материале и (b) средний размер олигосахариды, выпущенное GH. Метод добавляет одной молекулы флуоресцентные в уменьшение конец каждого олигосахариды, поэтому количество олигосахариды определяет чувствительность эксперимента. В качестве ориентира, glucomannan в стволовых Arabidopsis, переваривается с GH5/GH26 (как описано), 500 мкг рекомендуется 11, тогда как для xylan в стволовых Arabidopsis, переваривается с GH11, 100 мкг рекомендуется как Мортимер ' s исследования 3. весят воздух (10-15 мг) в 15 мл пластиковых пробирок и добавить H 2 O конечная концентрация 2 мг/мл. Вортекс для достижения даже подвеска. Если это создает проблему, затем использовать стекло гомогенизатор для содействия этому процессу. Трубы аликвота 500 мкг в отцентрифугировать. Сухие аликвоты, с помощью вакуума центрифуги (см. Таблицу материалов) всю ночь на 30 ° C. Воздух предварительно лечить с 1 M NaOH (20 мкл) за 1 ч при комнатной температуре; это де acetylates полисахаридов и набухает целлюлозы microfibrils, нарушая структуру биомассы и доступа GH. Примечание: Этот шаг может быть пропущен для очищенных полисахаридов. ОСТОРОЖНО – сильная кислота/base. Включают Алиготе для управления воздушным без фермента (обрабатывается так же, как все образцы, за исключением шага 4.1. исключается). Добавить 200 мкл H 2 O и 20 мкл 1 М HCl для нейтрализации. Тест, что pH ~ 6-7, удалив 1 мкл и кровянистые выделения его на полоски бумаги рН показатель. Добавьте 50 мкл 1 M аммония ацетат буфера, pH 6.0 (или какой рН подходит для используемых в исследовании СГС) и H 2 O дать общий объем 500 мкл. Примечание: Ацетат аммония используется, поскольку она отсняты при высыхании, и поэтому он не добавляет дополнительные соли для образца. Избыток соли может привести к плохой группы форма и резолюции ПАСЕ гель. 4. Гидролиз воздуха с Glycosyl гидролазы (СГС) Примечание: как уже упоминалось в ходе обсуждения, чистоту СГС имеет решающее значение. Использовать только участием выразил, близость очищенного ферментов. После получения каждой партии от производителя, гидролизуют определенных аликвоты субстрата (например, 500 мкг воздуха) с увеличением количества GH на ночь (например, 0.5, 1, 2, 5, 10, 15, 20 мкл) (3 единицы/мкл). Когда есть избыток GH, ПАСЕ отпечатков будет выглядеть одинаково. Избыток фермент требуется доставить воспроизводимость результатов, потому что он должен быть уверен, что реакция гидролиза приближается к конечной точки. Добавить заранее определенной суммы (см. выше) mannanases ( 11 GH5 и GH26) на аликвоты воздуха в буфер из шага 3.5, а также позитивного управления (30 мкг Конжак глюкоманнан) и без-AIR негативные (фермент смесь в пустая трубка). Вихрь и затем спина кратко для сбора реакционной смеси в нижней части трубки. На ночь Инкубируйте на 37 ° C (или соответствующей температуры для GH выбор) с нежным агитации (~ 100 об/мин). Остановка реакции инкубации на 95 ° C в течение 20 мин Примечание: Закрытие крышки может использоваться для уплотнения трубок флип топ отцентрифугировать. Центрифуга с помощью топ отцентрифугировать скамейке на максимальной скорости на 10 мин и сохранить супернатант. Ресуспензируйте Пелле в 250 мкл H 2 O, центрифуги, как указано выше и сохраните супернатант. Объединить оба supernatants и сушат в центрифугу вакуум (см. Таблицу материалов) при 30 ° C (~ 3 h или на ночь без нагрева). 5. Подготовка стандартов олигосахарида подготовить 1 приклад решения H 2 O маннозы (Man), mannobiose (2 человек), mannotriose (3 человек), mannotetraose (4 человек), mannopentaose (5 человек) и mannohexaose (6 человек), все β, 1-4 связаны. Алиготе и хранить при температуре-20 ° C до тех пор, пока требуется. Подготовить 3 разных концентрациях мужчина смесь 1-6, объединив 1 мкл (стандарт S1), 2 мкл (S2) или 5 мкл (S3) всех шести. Сухой в центрифугу вакуум (см. Таблицу материалов) при 30 ° C (~ 1 h). 6. Олигосахариды ввода подготовить раствор 0,2 М муравьев (8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic кислота) в H 2 O: уксусная кислота 17:3. Теплый склад до 60 ° C до полного растворения твердых. Хранить при-20 ° C, 2-3 месяцев, защищенном от света,. Подготовить раствор 0,2 М запасов Бороводороды 2-picoline (2-PB) в ДМСО. Это крайне гигроскопична, так сразу Ресуспензируйте все порошок по получении в ДМСО. Алиготе и хранить при-20 ° C для 1-2 лет. Оттепель аликвоты как требуется (хранить при 4 ° C на 2 недели, а затем отменить). Подготовить деривации буфера H 2 O: уксусной кислоты: ДМСО 17:3:20. Для каждого образца, добавить 5 мкл муравьев, 5 мкл 2-PB и 10 мкл буфера деривации. Спин кратко для сбора в нижней части трубки, вихревой тщательно и затем спина кратко. Смотрите Рисунок 1 для описания реакции. Образцы инкубировать на ночь при 37 ° C, защищать от света. Сухой в центрифугу вакуум (см. Таблицу материалов) при 30 ° C (~ 2 h). Образцы Ресуспензируйте и стандарт 100 мкл 3 M мочевины. Хранить при температуре-20 ° C, защищенный от света до тех пор, пока требуется. 7. Подготовка ПАСЕ гели Примечание: монтаж оборудования литья гель будет зависеть от бренда. Здесь мы uсистема вертикального электрофореза SE (см. Таблицу материалы), оборудованная с пластинами стекла 18 x 24 см и 1,5 мм распорки. Собрать гель заливочное оборудование за производителя ' s инструкции. Сделать 10 x ПАСЕ буфера (1 М трис-Борат, рН 8,2) следующим образом: добавить 121.14 g трис-базы ~ 400 мл H 2 O, и смеси растворить. Отрегулируйте пэ-аш 8.2 добавлением твердых борной кислоты (примерно 60 g), а затем сделать объем до 1 л Сделать 10% (w/v) Аммония пероксодисульфат (APS) фондовая H 2 O. Алиготе и хранить при-20 ° C. оттепель аликвоты раз, хранить при 4 ° C и отменить после 2 недель. Делать и залить разрешая гель. Для вышеуказанного оборудования 1 лари приравнивается к 50 мл. Смешайте в 50 мл трубки центрифуги, H 2 O (20.2 мл), 5 мл 10 x буфер ПАСЕ, 24,6 мл 40% акриламида/Bis акриламида (29: 1 acrylamide:Bis). (Предупреждение: токсичные). Добавить APS 200 мкл и 20 мкл N, N, N, N´-тетраметилсвинца Этилендиамин (TEMED). Инвертируйте осторожно смешать (чтобы избежать воздушных пузырей). Залейте гель с помощью серологических или другой большой объем пипетки, ~ 4 см ниже верхней части стеклянной пластины. Обратите внимание на возможность пузырьки воздуха, получать оказавшихся в геле. Если они делают, остановить заливки и наклон/ПТП гель для их освобождения. Наложение гель с изопропиловый спирт (легковоспламеняющиеся осторожно :) или, тщательно, H 2 O. разрешить гель полимеризоваться (20-30 минут), а затем слить верхний слой. Если используется изопропиловый спирт, затем смывают 2 x с H 2 O. сухим любой избыток жидкости с помощью промокательной бумаги. Сделать и залить штабелируя гель. Смесь 6,8 mL H 2 O, 1 мл 10 x ПАСЕ буфера, 2,8 мл акриламида/Bis акриламида (осторожностью: токсичных), 80 мкл APS и TEMED 8 мкл в пластиковых пробирок 15мл. Инвертировать смешивать и наложение поверх полимеризованной разрешая гель. Аккуратно вставьте Расчески, избегая захвата воздушных пузырей под гребнем зубов. Разрешить гель для полимеризации (20-30 мин), оберните влажной ткани, а затем в полиэтиленовую пленку и хранить при 4 ° C до тех пор, пока требуется. Магазин с расчески на месте. Примечание: ПАСЕ гели могут храниться максимум на 2 недели (хотя меньше чем 1 неделя идеально), если они хранятся влажные. 8. Запуск в темпе гель использовать перманентный маркер на этикетке также позиции на стекле, которая будет оказывать помощь в отслеживании порядок загрузки, и в выявлении где скважины после удаления гребень. Снимите гребень. Заполнить скважин с 1 x ПАСЕ буфера. Использовать 10 мкл microsyringe для загрузки 2 мкл образцов и стандартов в скважины. Избегайте использования внешней полосы, которые, как правило, для запуска образцов плохо. Сборка верхней палаты гель работает аппарат и поместите гель в запущенных танк охлажденным (~ 10 ° C) (10 ° C), содержащий 1 x ПАСЕ буфера. Заполните верхней палаты с 1 x ПАСЕ буфера. Поворот на власть и запустить геля на 200 V (Постоянная V) для 30 минут, а затем увеличение напряжения до 1000 V 1 ч 40 мин. Защищать Гели от света (например, заключив танков в черные мусорные мешки). Примечание: Проверка на гелях ~ 5 мин после включения напряжения и затем еще 5 минут после увеличения напряжения до 1000 В. Если блок питания не в состоянии поддерживать напряжение, то есть скорее всего буфера утечки. Удалите гель из бака. Соберите верхняя палата, тщательно проверять размещение всех прокладки. Большая микросхема на верхнем краю стеклянной пластины могут помешать пластины, образуя хорошее уплотнение с уплотнением. Это может обычно временно решена путем добавления капли расплавленного агарозы 5% (w/v) части сколы стекла, перед добавлением в верхней палате. 9. Визуализация ПАСЕ гель Примечание: используйте гель визуализации система с длинн развевайте УФ лампы в transilluminator и выбросов фильтр для камеры, которая подходит для Флюорофор, здесь 530 Нм. Кроме того, лазерный сканер может также использоваться, как описано в Goubet 2. Обеспечивает гель системы пыли, протереть влажной безворсовой ткани. Удалить гель из бака ПАСЕ и просмотр кратко гель находится все еще в стеклянные пластины (< 80 мс) для определения того, является ли краска фронт еще на геле. Открыть с помощью инструмента клин гель и в то время как гель еще на одной стеклянной пластины, использовать нож для пиццы для удаления обоих штабелируя гель и, если еще на геле, в нижней части геля краситель фронт. Положить на поверхность transilluminator ~ 5 mL H 2 O, а затем перенесите гель непосредственно на transilluminator. Установите фильтр для УФ 605 и включите длинноволнового УФ transilluminator (см. Таблицу материалы) с использованием программного обеспечения. Примечание: МУРАВЬИ Флюорофор, используемый здесь имеет возбуждение/излучение 353/520 Нм. Занять несколько изображений в разное время экспозиции (например, 100 мс до 10 s). Убедитесь, что УФ свет выключен между изображениями, нажав кнопку УФ света (чтобы отключить) чтобы избежать унижающего достоинство флуоресценции. Убедитесь, что по крайней мере 2 изображения имеют не насыщенных полос (гель обработки изображений программное обеспечение будет указывать это). Сохранять файлы как изображения высокой resolution.tif. Примечание: Изображения могут быть проанализированы с помощью программного обеспечения, поставляемого с гелем изображений системы, или с помощью программного обеспечения для анализа свободно доступных изображений, таких как ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). В разделе результаты для обсуждения quantitation.