속도 사용 하 여 식물에 Mannan 세포 벽 다 당 류 구조 특성

1. 식물 재료의 수확 신선한 식물 소재 (~ 20 밀리 그램)을 수확 즉시 96% (v/v) 에탄올에 잠수함 및 30 분 동안 70 ° C에서 품 어;이 비활성화 모든 세포 벽 타락 효소 존재. 건조 소재, 2 단계부터 시작. 주의: 에탄올은 인화성. 참고: 단일 줄기 또는 근 엽 잎 분석에 대 한 충분 한 자료를 제공할 것입니다. 그러나, 적은 오류 조직의 큰 금액 풀링된 이며 이것은 쉽게 밖으로 무게를 처리 분석 하는 경우 발생할. 신중 하 게 조직의 종류를 기록 하 고 발달 단계, 다 당 류 구조 변화 한다 둘 다. 예를 들어 애기 thaliana (사용된 여기)와 함께 Boyes 외에서 방법 조직 단계 15 참고:이 프로토콜에서 우리가 사용한 화 서 줄기의 아래쪽 첫 번째 silique 하지 yellowing 하지만 길쭉한 완전히. 2. 준비의 알코올 불용 성 잔류물 (공기) 준비 공기, 모 티 머 외의 방법을 9 또는 녹는 설탕, 자당, 전 분 등 부족 한 분말을 생성 하기 위해 다른 유사한 방법. 3. Aliquoting 및 전처리의 공기 참고: 각 샘플 자료에 대 한 관심의 다 당 류 및 oligosaccharides 발표의 평균 크기 (b)의 (a)는 풍부에 따라 달라 집니다에 필요한 공기의 정확한 양을 Gh입니다. 메서드는 oligosaccharides 수 실험의 감도 결정 하는 그래서 각 처리한후 줄이는 끝에 단 하나 형광 성 분자를 추가 합니다. 으로 GH5/GH26 (설명) 하는 대로로 소화 하는 애기 줄기에 만점 500 µ g는 것이 좋습니다 11, 반면 xylan GH11로 소화 하는 애기 줄기에, 100 µ g는 것이 좋습니다 모 티 머와 같이 ' s 연구 3. 15 mL 원심 분리기 튜브에 공기 (10-15 mg)를 무게 및 H 2 O 2 mg/mL의 최종 농도에 추가. 소용돌이 현 탁 액을 달성 하기 위해입니다. 이 문제가 있는 경우, 다음이 프로세스를 지원 하기 위해 유리 균질 화기를 사용. Aliquot 500 µ g microfuge에 튜브입니다. Aliquots 진공 원심 분리기를 사용 하 여 건조 (재료의 표 참조) 하룻밤에 30 ° c. 사전 치료 공기 1 M NaOH (20 µ L); 실 온에서 1 h이 드 acetylates는 다 당 류와 셀 룰 로스 microfibrils, 바이오 매스 구조 방해와 GH 접근 부. 참고:이 단계 정제 류 위해 생략 수 있습니다. 주의 – 강한 산 또는 기초. 아니 효소 공기 제어에 대 한 약 수 포함 (단계 4.1 제외 하 고 모든 샘플 취급. 제외). 추가 200 µ L H 2 O 및 20의 µ L 1 M HCl를 중화. 테스트는 pH는 1 µ L을 제거 하 고 종이 pH 지시자 지구에 안보 여 ~ 6-7. 추가 50 µ L 1m 암모늄 아세테이트 버퍼, pH 6.0 (또는 중 pH는 연구에 사용 된 GHs에 적합) 및 H 2 O 500 µ L의 총 볼륨 주고. 참고: 암모늄 아세테이트 그리고 추가 소금 샘플을 추가 하지 않습니다 그것은 건조, 따라 sublimes 이후 사용 됩니다. 소금의 과잉 속도 젤에 가난한 밴드 모양 및 해상도를 발생할 수 있습니다. 4. Glycosyl Hydrolases (GHs)와 공기의 가수분해 참고:는 GHs의 순수성은 중요 한 토론에 설명 했 듯이. Heterologously 표현 사용, 선호도 효소 정화. 제조 업체에서 많은 각을 접수 한 후, 하룻밤 GH의 수량 증가 함께 기판 (예를 들어, 500 µ g 공기)의 정의 된 aliquots은 (예를 들어, 0.5, 1, 2, 5, 10, 15, 20 µ L) (3 단위 / µ L). GH의 과잉이 있을 때, 속도 지문 동일 보일 것 이다. 효소의 과잉은 해야 하기 때문에 그것 특정 가수분해 반응 끝점 다가오고 재현 가능한 결과 제공 하는 데 필요한. 추가 단계 3.5에서에서 버퍼에 공기 aliquots mannanases (GH5 및 GH26 11) 긍정의 미리 정해진된 금액 (위 참조) 컨트롤 (곤 약 만점의 30 µ g), 그리고 아니오 공기 부정적인 컨트롤 (효소 혼합에는 빈 관)입니다. 소용돌이, 그리고 튜브의 하단에 반응 혼합물을 수집 하는 짧게 다음 스핀. 부드러운 동요 (~ 100 rpm)와 함께 37 ° C (또는 선택의 GH에 대 한 적절 한 온도)에서 밤새 품 어. 20 분 동안 95 ° C에서 배양 하 여 반응을 중지 참고: 모자 폐쇄 플립-가기 microfuge 관을 밀봉 하기 위하여 사용할 수 있습니다. 10 분, 최대 속도 벤치 가기 microfuge를 사용 하 여 원심과 상쾌한 유지. 250 µ L H 2 O, 원심 분리기, 위와 같이 펠 릿을 resuspend 하 고 상쾌한을 유지. 두 supernatants 결합 하 고 진공 원심 분리기에서 건조 (재료의 표 참조) 30 ° c (~ 3 h 또는 난방 없이 하룻밤). 5. 올리고 당 표준의 준비 H 2 O만 노 오 스 (남자), mannobiose (남자 2), mannotriose (맨 3), mannotetraose (남자 4), mannopentaose (남자 5)의 준비 1 m m 재고 솔루션 및 mannohexaose (남자 6), 모든 β, 1-4 연결. 약 수와-20 ° c까지 필요한 저장소. 1 µ L s (표준 1) 2 µ L (S2)를 결합 하 여 남자의 3 다른 농도 1-6 혼합 준비 또는 5 µ L (S3)의 모든 6. 진공 원심 분리기에서 건조 (재료의 표 참조) 30 ° c (~ 1 h). 6. Derivitization의 Oligosaccharides 준비 H 2 O에서에서 0.2 M 개미 (8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic 산)의 재고 솔루션: 초 산 17:3. 고체를 완전히 분해를 60 ° C에 따뜻한 주식. 2-3 개월에 대 한 빛에서 보호 하는-20 ° C에서 저장소. 는 DMSO에 2 삐 borane (2-PB)의 0.2 M 재고 솔루션을 준비합니다. 이것은 매우 검 습기 이다, 그래서 즉시 DMSO에 접수 한 후 모든 분말을 resuspend. 약 수, 그리고 1-2 년 동안-20 ° C에서 저장소. 필수 (2 주, 및 다음 삭제를 위한 4 ° C에서 저장소)로 aliquots를 녹여. H 2 O의 derivatization 버퍼 준비: DMSO 산: 아세트산 17: 3시 20분. 각 샘플, 개미, derivatization 버퍼의 2 PB 및 10 µ L의 5 µ L의 5 µ L을 추가. 짧게는 튜브의 하단에 수집 하는 회전 소용돌이 철저 하 게, 다음 짧게 다시 스핀. 그림 1 반응 설명을 참조 하십시오. 품 샘플 빛 으로부터 보호 37 ° C에서 하룻밤. 진공 원심 분리기에서 건조 (재료의 표 참조) 30 ° c (~ 2 h). Resuspend 샘플 및 100 µ L 3 M 요소에 표준. 필요할 때까지 빛에서 보호 하는-20 ° C에서 저장소. 7. 속도의 준비 젤 참고: 젤 주조 장비의 조립 브랜드에 따라 달라 집니다. 여기, 우리 use 수직 전기 시스템 (재료의 표 참조)를 갖춘 18 cm x 24 cm 유리 접시와 1.5 m m 스페이서. 조립 제조 업체 당 젤 주조 장비 ' s 지침. 확인 10 배 속도 버퍼 (1 M Tris-붕 산 염, pH 8.2) 다음과 같이: 트리 스 베이스의 121.14 g H 2 O, 그리고 해산 믹스의 ~ 400 mL에 추가. 단단한 붕 (약 60 g)의 추가 의해 8.2에 pH를 조정 하 고 다음 1 볼륨 L. 10% (w/v) 염화 persulfate (AP) 주식 H 2 o. 약 수와 한 번-20 ° c. 해 동 aliquots에서 저장, 4 ° C에서 저장 만들고 2 주 후 삭제. 만들고 해결 젤을 붓는 다. 위의 장비에 대 한 1 젤 50 mL에 동일시 한다. 50 mL 원심 분리기 튜브, H 2 O (20.2 mL), 5ml 10 배 속도 버퍼, 24.6 mL 40% 아크릴 아 미드/비스-아크릴 (29: 1 acrylamide:Bis) 혼합. (주의: 독성). APS의 200 µ L과 N, N, N, N´-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED) 20 µ L 추가. (소개 하는 기포 방지)을 섞어 부드럽게 반전. 사용 하는 혈 청 학적인 젤 또는 다른 대용량 피 펫, ~ 4 cm 유리 접시의 맨 아래에 부 어. 공기 방울 젤에 갇혀 지 고의 가능성에 주목. 만약 그들이 할 따르고, 멈추고 틸트/탭 해제 하 젤. 소 프로 파 놀 (주의: : 가연성) 또는, 신중 하 게, H 2 유해 (20-30 분), 다음 상위 레이어 부 O. 허용 젤 젤 오버레이. 소 프로 파 놀, 사용 하는 경우 다음 씻어 H 2 o. 드라이 2 배 압 지를 사용 하 여 모든 초과 액체. 만들고 겹쳐 쌓이는 젤을 붓는 다. 6.8 mL H 2 O, 1 mL 10 배 속도 버퍼, 2.8 mL 아크릴 아 미드/비스-아크릴 믹스 (주의: 독성), 80 µ L APS와 15ml 원심 관에 TEMED의 8 µ L. 생산 해결 젤 위에 오버레이 및 혼합, 반전. 부드럽게 빗, 빗 이빨에서 트랩 공기 방울을 피하 삽입. 허용 젤 (20-30 분), 유해 촉촉한 조직 그리고, 플라스틱 포장에서 포장 하 고 필요할 때까지 4 ° C에서 저장 합니다. 매장 장소에 빗. 참고: 젤 속도 저장 될 수 있다 최대 2 주 동안 (비록 1 주 미만 이상적 이다), 그들은 습 한 유지 하는 경우. 8. 실행 속도 젤 영구 마커를 사용 하 여 로드 순서를의 추적을 유지에 도움이 될 것입니다, 유리에 잘 위치를 그리고 어디 식별 우물 빗 제거 되 면. 빗을 제거합니다. 1 x 속도 버퍼에 채울 우물. 10 µ L microsyringe를 사용 하 여 우물에 표준 및 샘플 2 µ L을 로드. 샘플을 제대로 실행 하는 경향이 가장 바깥쪽 차선을 사용 하지 마십시오. 젤 실행 기구의 상단 챔버를 조립 하 고 1 x 속도로 버퍼를 포함 하는 냉각된 (~ 10 ° C) 실행 탱크 (10 ° C)에서 젤 장소. 1 x 속도 버퍼에 채워 상단 챔버. 설정 능력과 실행 200 V 젤 (상수 V) 30 분, 그리고 1000 V 증가 전압에 대 한 1 시간 40 분. 빛 (예를 들어, 검은 쓰레기 봉투에 탱크를 배치 하 여)에서 젤을 보호. 참고: 1000 V 전압을 증가 후 전압, 설정 하 고 다른 5 분 후 젤 ~ 5 분에 확인 하십시오. 파워 팩 버퍼 누출 가능성이 다음 전압을 유지할 수 없는 경우에. 탱크에서 젤을 제거 합니다. 상부 챔버, 모든 가스 켓의 배치를 신중 하 게 검사를 재조 립. 유리 접시의 위쪽 가장자리에 큰 칩 개 스와 함께 좋은 물개를 형성 하는 접시를 방지할 수 있습니다. 이 일반적으로 일시적으로 해결 될 상단 챔버를 추가 하기 전에 유리의 부서진된 부분에 5% (w/v) 녹은 agarose의 한 방울을 추가 하 여. 9. 페이스 젤 시각화 참고: 이미징 시스템 긴 웨이브 UV 전구는 transilluminator에 fluorophore, 여기 530 nm에 대 한 적합 한 카메라에 대 한 배출 필터를 장착 하는 젤을 사용 하 여. 또한, 레이저 스캐너도 사용할 수 있습니다, Goubet 2에서 설명한 대로. 이미징 시스템 젤 촉촉한 보풀 티슈로 닦아 먼지 무료입니다 보장. 속도 탱크에서 젤을 제거 하 고 젤은 유리 접시에 아직도 하는 동안 간단히 볼 (< 80 ms) 젤에 아직도 염료 앞 인지 확인 하려면. 젤 쐐기 도구를 사용 하 여 열고 젤 한 유리 접시에 아직도 하는 동안 피자 커터를 사용 하 여 모두 겹쳐 쌓이는 젤을 제거 하 고 염료 전면 젤, 젤의 하단에 남아 있으면. 는 Transilluminator의 표면에 ~ 5 mL H 2 O 넣은 다음은 transilluminator에 직접 젤을 전송 합니다. UV 605에 필터를 설정 하 고 장파 UV transilluminator 설정 (재료의 표 참조) 소프트웨어를 사용 하 여. 참고: 여기에 사용 되는 개미 fluorophore는 흥분/353/520의 방출 nm. 다양 한 노출 시간에 여러 이미지를 (예를 들어, 10 100 ms s). UV 빛 형광 저하를 피하기 위해 UV 빛 단추 (해제)를 클릭 하 여 이미지 사이 해제 되어 있는지 확인 합니다. 이미지의 적어도 2는 없는 포화 밴드 (이미징 소프트웨어 젤이 표시 됩니다) 확인 하십시오. 높은 resolution.tif 이미지 파일을 저장 하는 . 참고: 이미지를 분석할 수 있습니다 이미징 시스템, 젤 또는 ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) 등 자유롭게 사용 가능한 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 제공 하는 소프트웨어를 사용 하 여. 정량에 대 한 논의 결과 섹션을 참조 하십시오.