توصيف الهيكلية من السكريات جدار الخلية المنان في النباتات باستخدام خطي
Summary
ويرد وصف بروتوكول للتحليل الهيكلي للسكريات بهلام التفريد (PACE)، استخدام المنان على سبيل مثال،.
Abstract
السكريات جدار الخلية النباتية، يصعب تحليلها، ومعظم الأساليب يتطلب معدات غالية الثمن والمشغلين المهرة، وكميات كبيرة من المواد النقية. وهنا، يمكننا وصف بسيط الأسلوب للحصول على مفصلة المعلومات السكاريد الهيكلية، بما في ذلك قرار ايزومرات الهيكلي. لتحليل السكاريد بالتفريد هلام (PACE)، هو تحلل المواد جدار الخلية النباتية مع hydrolases glycosyl محددة إلى السكاريد الفائدة (مثلاً، ماناناسيس المنان). ثم تستخدم تنسيق كبير polyacrylamide الهلام لفصل oligosaccharides المفرج عنهم، وقد وصفت فلوريسسينتلي. يمكن تصور الهلام مع هلام تعديل نظام التصوير (انظر الجدول للمواد). بصمة oligosaccharide الناتجة يمكن أما مقارنة نوعيا، أو مع النسخ المتماثل، كمياً. الربط والمعلومات التفريعي يمكن إنشاء باستخدام hydrolases glycosyl إضافية (مثل مانوسيداسيس وجالاكتوسيداسيس). بينما يصف هذا البروتوكول وسيلة لتحليل هيكل glucomannan، أنه يمكن تطبيقها على أي السكاريد التي تتسم جليكوسيل هيدرولاسيس موجودة. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدامه لتميز hydrolases glycosyl رواية استخدام ركائز السكاريد محددة.
Introduction
تحليل السكاريد بالتفريد هلام (PACE) أسلوب لوصف مفصل للسكريات1،،من23. السكريات جدار الخلية النباتية، يصعب تحليلها، ومعظم الأساليب يتطلب معدات غالية الثمن والمشغلين المهرة، وكميات كبيرة من المواد النقية. وهنا، يمكننا وصف بسيط الأسلوب للحصول على مفصلة المعلومات السكاريد الهيكلية، بما في ذلك قرار ايزومرات الهيكلي.
فهم مصنع جدار الخلية السكاريد بنية ضروري لهؤلاء الباحثون استكشاف الحيوي جدار الخلية النباتية أو دور جدار الخلية النباتية في تطور النبات. في الآونة الأخيرة، ومع ذلك، تكوين جدار الخلية النباتية أصبحت مثيرة للاهتمام لمجموعة أوسع نطاقا من الباحثين بسبب التركيز على استخدام الكتلة الحيوية النباتية (أساسا جدار الخلية) كمادة وسيطة لإنتاج الوقود الأحيائي وبيوشميكلس4. على سبيل مثال، يتطلب ساكتشاريفيكيشن الانزيمية كفاءة هذه المواد فهم مفصل لهياكل السكاريد، حتى يمكن الكوكتيل الانزيمية الأمثل المحدد5.
وتيرة مزايا عديدة على الطرق البديلة التي تجعله مثاليا للتحليل السريع للهياكل المعقدة جليكان. أولاً، أنها لا تتطلب تنقية السكاريد في السؤال، كما هو مطلوب لحل الدولة الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي)6. وثانيا، يمكن حل وتيرة ايزومرات الهيكلي، على عكس الكتلي (مرض التصلب العصبي المتعدد، مثلاً، ساعد مصفوفة الليزر الامتزاز/التأين (استخدام) والتاين اليكتروسبراي (ESI))، التي يمكن أيضا أن يكون تحديا لتنفيذ بواسطة اللوني السائل (ش) 7-ثالثا، وتيرة حساس جداً، مع القرار منخفض-بيكومولي، على عكس كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) أو الفصل اللوني للورق. وأخيراً، أنها لا تتطلب معرفة المعدات أو أخصائي مكلفة، كما الحال لمرض التصلب العصبي المتعدد، والرنين المغناطيسي، و LC.
الأسلوب الخطي يعتمد على خصوصية جليكوسيل هيدرولاز (غ) الإنزيمات، التي تستهدف بعض الروابط glycosidic في خليط السكريات. عندما يعمل الإنزيم هرمون النمو على سلسلة السكاريد، فإنه يكشف عن وضع نهاية الحد الذي يمكن ثم يتم كيميائيا ديريفاتيزيد، في هذه الحالة مع تسمية فلورسنت. ولذلك أصبح الجزء أونهيدروليزيد من العينة لا يمكن الكشف عنها بهذا الأسلوب. ثم يتم فصل oligosaccharides المسمى في هلام اكريلاميد تنسيق كبير بالتفريد. وهذا يعطي القرار ممتاز لجزيئات مشابهة جداً، على سبيل المثال، سيكون تريساكتشاريديس الأخضر-رجل-رجل والأخضر-الرجل-الأخضر R مختلفةو.
وقد استخدمت على نطاق واسع وتيرة تميز الهياكل إكسيلان مختلفة عبر الأنواع النباتية8، لتحديد طفرات جليكوسيلترانسفيراسي في نبات6،،من910،11 لإجراء فحوصات جليكوسيلترانسفيراسي9وتميز رواية غ الأنشطة12،13. نحن أيضا في الآونة الأخيرة استخدامه لتوصيف المنان جدار خلية الخميرة (محبوبي ومورتيمر، في إعداد). هنا يصف لنا طريقة لوصف بنية glucomannan جدار الخلية النباتية، استناداً إلى التقارير السابقة11،14.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتيرة أسلوب مباشر لوصف بنية السكاريد. ويمكن تطبيقها لأي السكاريد التي معروفة هناك النظام المتوائم مع النشاط تتسم، راجع أمثلة عديدة في الأدب1،،من69،11. ترينيداد وتوباغو وطبق أيضا وصف رواية النظام المتوائم12،،من1318 وجليكوسيلترانسفيراسيس9، بجعل استخدام ركائز السكاريد المعرفة ومتقبلون.
النتائج استنساخه، والتفسير التي تعتمد على ثلاث خطوات رئيسية. أولاً، ينبغي أن يكون النظام المتوائم المستخدمة خالية من تلويث الأنشطة. وهذا أفضل يتحقق عن طريق استخدام فقط أعربت عن هيتيرولوجوسلي، تقارب تنقية الإنزيمات. ثانيا، لمعظم التجارب، من المهم أن التحلل المائي الأنزيمي لركائز إنجاز. وهذا يضمن أن يعطي نفس الكتلة الأحيائية تحلل مع هرمون النمو نفس بصمات الأصابع نفسها في كل تجربة. أخيرا، ينبغي أن يكون هناك فائض في فلوروفوري في رد فعل derivatization. وهذا ما يضمن أن ينتهي الحد المتاحة هي المسمى في ما يقرب من 100%. وهذا سيؤدي إلى إمكانية تكرار نتائج عالية من النتائج، فضلا عن البيانات الكمية.
هلام وكاشف نوعية ذات الأهمية الحاسمة لضمان البيانات استنساخه. المخازن المؤقتة رديئة النوعية، خاصة بالنسبة لدرجة الحموضة غير صحيحة، الهواء فقاعات في الهلام، وعينات مع وجود فائض ملح يمكن أن تؤثر على جميع القرار والاحتفاظ بعامل من oligosaccharides. ومع ذلك، سيمكن إدراج عناصر التحكم الموصى بها الموضحة في قسم البروتوكول و النتائج استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
وتيرة يحد من قدرته على تحديد أوليجوساكتشاريديس. لبعض التجارب، وبصمات الأصابع بسيط هو كل ما ضروري. مع ذلك، حقاً قوانتيتاتي مبلغ glucomannan في عينة هواء، على سبيل المثال، هوية جميع oligosaccharides تم إصدارها المطلوب، وهي عملية تستغرق وقتاً طويلاً. وهذا أكثر وضوحاً لأقل السكريات المعقدة مثل زيلان3. أن هناك معايير oligosaccharide القليلة المتاحة تجارياً، قد لا دائماً يكون ممكناً أو مرغوباً فيه للتعرف على جميع النطاقات. في هذه الحالة، يمكن أن توفر سرعة بيانات مجانية جداً إلى الطيف الكتلي (أي استخدام–سيد9 أو أي إس أي–مايكروسوفت7، والرنين المغناطيسي النووي6). لهذه الأساليب، يكون من المفيد عادة القيام إعداد كبيرة، وفصل بحجم الاستبعاد اللوني، وثم تحليل كل جزء من كلا خطي قبل مرض التصلب العصبي المتعدد أو الرنين المغناطيسي النووي. بينما أفيد أن العصابات يمكن اقتطعت وتحديدها باستخدام–سيد، في الممارسة وقد وجدنا أن هذا انخفاض معدل النجاح (ربما بسبب التفاعلات oligosaccharides المسمى مع هلام الاكريلاميد عند تعريضه للأشعة فوق البنفسجية).
هو الحد الرئيسية الأخرى من وتيرة الإنتاجية. بنوعية جيدة، والمواد الهلامية التفسير مع الضوابط المناسبة، وسوف يكون كل جل فقط ~ 10 عينات تجريبية، وباحث يمكن أن نتوقع أن تشغيل ~ 4 وتيرة الجل يوميا. إصدار من وتيرة استخدام التفريد الشعرية (CE) في الآونة الأخيرة نمواً19، الذي يسمح إعداد العينات في لوحات 96-جيدا. أنها استخدمت بنجاح لوصف نشاطات الإنزيم جليكوسيلترانسفيراسي والسكاريد هياكل6،19، على الرغم من أنه يتطلب الوصول إلى جهاز CE، والتي يمكن أن تكون مكلفة شراء وصيانة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وضعت طريقة خطي والأمثل من قبل مختلف أعضاء الفريق دوبري (جامعة كامبريدج، المملكة المتحدة) على مر السنين، ونحن نقدر جميع مساهماتها. تم تمويل هذا العمل كجزء من معهد الطاقة الحيوية المشترك الكيان التشغيلي المعين (http://www.jbei.org) تدعمها وزارة الطاقة الأمريكية، ومكتب العلوم ومكتب البيولوجية والبحوث البيئية، عن طريق عقد دي-AC02-05CH11231 بين لورانس مختبر بيركلي الوطني ووزارة الطاقة الأمريكية. ونشكر أيضا اختيار ثيا والمنظمات Vy للمساعدة في إعداد العينات csla9 .
Materials
| Oligosaccaharide Standards | |||
| Mannose | Sigma-Aldrich | CAS 3458-28-4 | |
| Mannobiose | Megazyme | CAS: 14417-51-7 | |
| Mannotriose | Megazyme | CAS: 28173-52-6 | |
| Mannotetraose | Megazyme | CAS: 51327-76-5 | |
| Mannopentaose | Megazyme | CAS: 70281-35-5 | |
| Mannhexaose | Megazyme | CAS: 70281-36-6 | |
| Glucomannan (Konjac; Low Viscosity) | Megazyme | P-GLCML | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other specialty chemicals | |||
| 8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid | (Molecular probes) Thermo | A350 | |
| 2-picoline borane | TCI | B3018 | |
| 40 % acrylamide/Bis-acrylamide (29:1 acrylamide:Bis) | Bio-rad | 1610146 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Specialty Equipment | |||
| Gel casting kit | Hoefer | SE660 kit | 18×24 cm glass plates, 0.75 mm spacers |
| Cooling recirculating water bath | Hoefer | RCB20-plus 115v | Needs to be able to maintain temperature at ~10 C |
| G:Box Chemi XRQ Imaging System | Syngene | 05-GBOX-CHEMI-XRQ | Order with filters appropriate to fluorphore, and transilluminator should be fitted with long-wave UV light bulbs |
| High Voltage Power Pack | Thermo | EC1000XL | 1000V |
| Vacuum centrifuge(Speedvac) | Savant | SPD131 | |
| Vertical Gel electrophoresis system | Hoefer | SE660 | |
| Glycosyl hydrolases | |||
| These can be obtained from companies e.g. Megazyme (https://www.megazyme.com/) or Prozomix (http://www.prozomix.com/), or can be expressed in house by requesting the plasmid from the relevant research group. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab supplies | |||
| 15 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning) | VWR | 21008-918 | |
| 50 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning) | VWR | 21008-951 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Gel imaging software ( Genesys) | Syngene |
References
- Barton, C. J., et al. Enzymatic fingerprinting of Arabidopsis pectic polysaccharides using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE). Planta. 224 (1), 163-174 (2006).
- Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: A method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases. Anal Biochem. 300 (1), 53-68 (2002).
- Mortimer, J. C. Structural Analysis of Cell Wall Polysaccharides Using PACE. Methods Mol Biol. 1544, 223-231 (2017).
- Pauly, M., Keegstra, K. Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels. Plant J. 54 (4), 559-568 (2008).
- Lopez-Casado, G., Urbanowicz, B. R., Damasceno, C. M., Rose, J. K. Plant glycosyl hydrolases and biofuels: a natural marriage. Curr Opin Plant Biol. 11 (3), 329-337 (2008).
- Mortimer, J. C., et al. An unusual xylan in Arabidopsis primary cell walls is synthesised by GUX3, IRX9L, IRX10L and IRX14. Plant J. 83 (3), 413-426 (2015).
- Ridlova, G., Mortimer, J. C., Maslen, S. L., Dupree, P., Stephens, E. Oligosaccharide relative quantitation using isotope tagging and normal-phase liquid chromatography/mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 22 (17), 2723-2730 (2008).
- Busse-Wicher, M., et al. Evolution of Xylan Substitution Patterns in Gymnosperms and Angiosperms: Implications for Xylan Interaction with Cellulose. Plant Physiol. 171 (4), 2418-2431 (2016).
- Mortimer, J., et al. Absence of branches from xylan in Arabidopsis gux mutants reveals potential for simplification of lignocellulosic biomass. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (40), 17409-17414 (2010).
- Anders, N., et al. Glycosyl transferases in family 61 mediate arabinofuranosyl transfer onto xylan in grasses. Proc Nat Acad Sci USA. 109 (3), 989-993 (2012).
- Goubet, F., et al. Cell wall glucomannan in Arabidopsis is synthesised by CSLA glycosyltransferases, and influences the progression of embryogenesis. Plant J. 60 (3), 527-538 (2009).
- Rogowski, A., et al. Evidence That GH115 alpha-Glucuronidase Activity, Which Is Required to Degrade Plant Biomass, Is Dependent on Conformational Flexibility. J Biol Chem. 289 (1), 53-64 (2014).
- Rogowski, A., et al. Glycan complexity dictates microbial resource allocation in the large intestine. Nat Commun. 6, 7481 (2015).
- Handford, M. G., et al. Localisation and characterisation of cell wall mannan polysaccharides in Arabidopsis thaliana. Planta. 218 (1), 27-36 (2003).
- Boyes, D. C., et al. Growth stage-based phenotypic analysis of Arabidopsis: a model for high throughput functional genomics in plants. Plant Cell. 13 (7), 1499-1510 (2001).
- . . The Carbohydrate Active Enzyme Database. , (2017).
- Hogg, D., et al. The modular architecture of Cellvibrio japonicus mannanases in glycoside hydrolase families 5 and 26 points to differences in their role in mannan degradation. Biochem J. 371, 1027-1043 (2003).
- Brennan, Y., et al. Unusual microbial xylanases from insect guts. Appl Environ Microbiol. 70 (6), 3609-3617 (2004).
- Li, X., et al. Development and application of a high throughput carbohydrate profiling technique for analyzing plant cell wall polysaccharides and carbohydrate active enzymes. Biotechnol Biofuels. 6, (2013).
