Determinar tasas de decaimiento de transcripción del genoma en quietos y proliferación de fibroblastos humanos
Summary
Se describe un protocolo para generar la proliferación y fibroblastos dérmicos humanos primarios quietos, seguimiento las tasas de decaimiento de transcripción y la identificación de genes diferencialmente decadentes.
Abstract
Quietud es un estado temporal, reversible en el que las células han dejado de división celular, pero conservan la capacidad de proliferar. Varios estudios, incluido el nuestro, han demostrado que la quietud se asocia con cambios generalizados en la expresión génica. Algunos de estos cambios se producen a través de cambios en el nivel o la actividad asociada a la proliferación de factores de transcripción, como E2F y MYC. Hemos demostrado que el decaimiento del mRNA también puede contribuir a cambios en la expresión génica entre células proliferantes y quietas. En este protocolo, se describe el procedimiento para el establecimiento de culturas quietas y proliferación de fibroblastos humanos de prepucio cutáneo. A continuación describimos los procedimientos para inhibir la nueva transcripción en las células proliferantes y quietas con actinomicina D (ActD). ActD tratamiento representa un enfoque sencillo y reproducible a disociar la nueva transcripción de la descomposición de la transcripción. Una desventaja del ActD tratamiento es que el curso del tiempo debe ser limitado a un corto plazo porque ActD afecta la viabilidad celular. Niveles de transcripción son monitoreados en el tiempo para determinar las tasas de decaimiento de transcripción. Este procedimiento permite la identificación de genes y de isoformas que exhiben decaimiento diferencial en proliferación contra fibroblastos quiescentes.
Introduction
Niveles de estado estacionario de transcripciones reflejan la contribución de síntesis transcripción y decaimiento de la transcripción. Regulado y coordinado de la transcripción es un importante mecanismo de control de procesos biológicos1,2,3,4. Por ejemplo, tasas de decaimiento de transcripción han demostrado para contribuir a la serie temporal de acontecimientos después de la activación por el factor de necrosis tumoral citoquinas inflamatorias del5.
Previamente hemos demostrado que la transición entre la proliferación y quietud en fibroblastos humanos primarios se asocia con cambios en los niveles de transcripción de muchos genes6. Algunos de estos cambios reflejan las diferencias en la actividad de factores de transcripción entre estos dos Estados.
Cambios en la tasa de decaimiento de una transcripción también pueden contribuir a cambios en el nivel de expresión de una transcripción en dos diferentes Estados7,8. Basado en los resultados anteriores que la transición entre la proliferación y la inactividad se asocia con cambios en los niveles de varios microRNAs9, le preguntamos si también hay una contribución de la descomposición de la transcripción diferencial de los cambios expresión génica en proliferación contra fibroblastos quiescentes.
Para monitorear la estabilidad de la transcripción, se determinó la tasa de decaimiento de las transcripciones genoma en proliferación versus células quiescentes. Para lograr esto, supervisamos las tasas de decaimiento en proliferación contra fibroblastos quiescentes introduciendo un inhibidor de la transcripción nueva y monitoreo de la tasa en que desaparecieron expedientes individuales con el tiempo. La ventaja de este enfoque es que, en comparación con los métodos que simplemente controlar la expresión génica global, por inhibición de la síntesis nueva de transcripción, seremos capaces de determinar la tasa de decaimiento de estas transcripciones por separado de la tasa a la que son transcrito.
ActD tratamiento para inhibir transcripción nueva y para determinar las tasas de decaimiento de transcripción se ha aplicado con éxito en múltiples estudios anteriores. ActD se ha utilizado para disecar la importancia de la estabilidad del RNA en los cambios en la abundancia de transcripción que resultan del tratamiento con citoquinas proinflamatorias5. Un enfoque similar también se ha utilizado para disecar las diferencias en la tasa de decaimiento de transcripción en proliferación versus células C2C12 diferenciadas como adoptan un fenotipo muscular diferenciado del10. Otro ejemplo, global mRNA vida media también se han detectado en pluripotentes y11de las células madre embrionarias de ratón distinguido. En estos ejemplos, decaimiento del mRNA se ha demostrado para ser importante para la regulación de la abundancia de transcripción y para la transición de células a células diferentes Estados.
Aplicación de los métodos descritos a continuación, descubrimos cambios en las tasas de decaimiento de la transcripción en aproximadamente 500 genes cuando se comparan los fibroblastos en proliferación y quieto Estados12. En particular, hemos descubierto que los objetivos del microRNA miR-29, que es regulada en células quiescentes, se estabilizan cuando las células de transición a la inactividad. Aquí describimos la metodología que se utilizó para determinar las tasas de decaimiento en las células proliferantes y quietas. Esta metodología es útil para comparar las tasas de decaimiento mRNA mundiales en dos distintos pero similares condiciones cuando se busca información sobre genes el decaerse rápidamente. También podría utilizarse para abordar otras cuestiones como el efecto de las condiciones de cultivo celular en decaimiento de la transcripción, por ejemplo, en dos dimensiones versus tres culturas dimensionales. Las tasas de decaimiento pueden ser genoma determinado con métodos tales como microarrays o RNA-seq. alternativamente, qPCR en tiempo real o el borrar norteño puede utilizarse para determinar las tasas de decaimiento en una base de gen por gen o isoforma de la isoforma. Estas tasas pueden utilizarse para calcular la vida media de cada gen supervisada y para identificar genes con índices de caries que son diferentes en dos condiciones.
Protocol
Representative Results
Discussion
Quietud puede ser inducida por señales externas, incluyendo retiro de mitógenos o suero, falta de adhesión celular y la inhibición de contacto. Inhibición de contacto, uno de varios posibles métodos para inducir la quietud, es un proceso altamente evolutionarily conservado en el que las células de salida ciclo celular proliferativo en respuesta a contacto de célula a célula. Nos centramos aquí en inhibición de contacto como un ejemplo de un método para inducir la quietud. Estudios previos han reportado que co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HAC fue la Milton E. Cassel de la Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Este trabajo fue financiado por subvenciones para HAC (P.I. David Botstein), Instituto Nacional de Ciencias de Medicina General del centro de la beca de excelencia P50 GM071508 PhRMA Foundation grant 2007RSGl9572, ciencia nacional Fundación beca OCI-1047879 David agosto, Nacional Institute of General Medical Ciencias R01 GM081686, Instituto Nacional de ciencias médicas General R01 GM0866465, Eli & Edythe Broad Center de medicina regenerativa & investigación con células madre, centro de salud/UCLA CTSI NIH de la mujer Iris Cantor Grant UL1TR000124 y la sociedad de la leucemia linfoma. Investigación en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional del cáncer de los institutos nacionales de salud bajo la concesión número P50CA092131. Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o preparación del manuscrito. HAC es un miembro del Eli & Edythe amplia centro de medicina regenerativa & investigación con células madre, el Instituto de Biología Molecular de la UCLA y el programa interdepartamental de Bioinformática de UCLA.
Materials
| Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4°C | |||
| Equipment for running agarose gels | |||
| Sterile tissue culture plates and conical tubes | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-118 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 35-010-CV | |
| Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture | |||
| Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis | |||
| Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples | |||
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | For decontaminating work surfaces from RNase |
| 2.0 ml eppendorf tubes | |||
| Trypsin-EDTA Solution 10X | Millipore Sigma | 9002-07-07 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Actinomycin D | Millipore Sigma | A1410-2 mg | inhibits transcription |
| Sterile DMSO | Fisher Scientific | 31-761-00ML | solvent for actinomycin D |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | ICN19400225 | MP Biomedicals, Inc product |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618500 | molecular biology grade |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | molecular biology grade |
| RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution) | Thermo Fisher Scientific | R0551 | carrier for RNA precipitation |
| TURBO DNA-free Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1907 | removes DNA with DNase, then, in a subsequent step, inactivates DNA and removes divalent cations |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | ICN820721 | MP Biomedicals, Inc product |
| Loading dye for RNA gel | Thermo Fisher Scientific | R0641 | suitable even for denaturing electrophoresis |
| Millenium RNA markers | Thermo Fisher Scientific | AM7150 | RNA ladder |
| One-color RNA Spike-in Kit | Agilent Technology | 5188-5282 | Example spike-in control for Agient microarray analysis |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | molecular biology grade, for TAE buffer |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | for TAE buffer |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | electrophoresis grade, for gels |
| Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | for molecular biology |
| External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | Spike-in control for RNA Seq |
| TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes) | Illumina | RS-122-2101 | for RNA Seq |
| 96-well 0.3 ml PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB-0600 | for real-time qPCR |
| Microseal B adhesive seals | Bio-Rad | MSB1001 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs | VWR | 89094-662 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | for real-time qPCR |
| SuperScript Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | for real-time qPCR |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | for real-time qPCR |
References
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