Hedef hücre ön zenginleştirme ve tüm genom amplifikasyon tek hücre aşağı akım karakterizasyonu için
Summary
Yeniden elde etmek ve moleküler genetik karakterizasyon tek hücre düzeyinde bir karışımı nadir Hedef hücrelerden olmayan hedef arka plan hücrelerle hazırlamak protokolüdür. DNA kalitesi olmayan tedavi tek hücrelere eşittir ve (her iki tarama tabanlı ve analiz hedefli) tek hücreli uygulama için sağlar.
Abstract
Nadir hedef hücreleri hedef hücre yüzey proteinleri ilişkin antikorlar özel kullanarak hedef olmayan hücre yüksek bir arka plan ayrılmış olabilir. Son zamanlarda gelişmiş bir yöntem tıbbi bir tel ile Anti-epitel hücre adezyon molekülü (EpCAM) antikorları tümör hücreleri (CTCs)1dolaşan vivo içinde yalıtım için functionalized kullanır. Hasta eşlemeli bir kohort sigara metastatik prostat Kanserinde vivo içinde yalıtım teknik CTCs yanı sıra geçerli altın standart CTC numaralandırma kıyasla daha yüksek CTC sayıları için pozitif hastalar daha yüksek bir yüzdesi sonuçlandı gösterdi. (Aygıtı olarak adlandırılır) yeni functionalized dinleme cihazı gibi hücreleri geçerli tıbbi cihazlardan kurtarılamaz, enzimatik tedavi ile yakalama ve hücre sonraki dekolmanı izin üretildi. Hücreleri mikroskop üzerinde görüntülenir ve enzimatik tedavi kullanarak müstakil aygıt eklemek için izin verilir. Kurtarılan hücre membran kaplı slaytlar üzerine cytocentrifuged vardır ve tek tek lazer mikrodiseksiyon veya Embriyolardan yoluyla hasat. Tek hücre örnekleri sonra eleme ve hedef özgü yaklaşımlar da dahil olmak üzere birden çok akış aşağı analiz izin tek hücreli tüm genom amplifikasyon tabi tutulmaktadır. İzolasyon ve kurtarma yordamı yüksek kalitede DNA tek hücreden verimleri ve sonraki tüm genom amplifikasyon (WGA) zarar değil. Tek bir hücrenin güçlendirilmiş DNA tarama için iletilebilir ve/veya analiz dizi karşılaştırmalı genom hibridizasyon (dizi-CGH) veya sıralama gibi hedef. Cihazın yapay nadir hücre örnekleri (5 mL periferik kan çiviliYani 500 hedef hücreleri) ex vivo izolasyon sağlar. Dekolmanı oranları hücre kabul edilebilir (50-%90) ise, geniş bir cep telefonda kullanılan bağımlı slayta müstakil hücreleri iyileşme oranı yayılan ( % 50) ve biraz daha fazla dikkat gerekir. Bu aygıt hastalarda kullanım için temizlenmez.
Introduction
Son zamanlarda, CellCollector DC01, kanser hastaları, periferik kandan CTCs izole için anti-EpCAM antikorlar ile functionalized bir tıbbi tel CTC numaralandırma1,2,3 metodik spektrum eklendi . Sigara metastatik prostat kanseri şu anda devam eden bir çalışmada, bu functionalized Tel neredeyse iki katı kadar hastalar CTC-pozitif raporları ve CTC-pozitif hastaların CellSearch, CTC numaralandırma3 altın standart kıyasla daha yüksek CTC sayar . Bu cesaret verici performans nedeniyle yalıtım functionalized tıbbi dinleme cihazı tek hücre analizi için hücre arzu olurdu ama ne hücre dekolmanı Çözümleri (örneğin tripsin) ile enzimatik tedavi ne lazer mikrodiseksiyon sağlar sağlam hücreleri (veri gösterilmez) kurtarma.
Yakalanan hücre dekolmanı izin vermek için yeni nesil functionalized teller belirli bir polimer ile donatılmıştı. Tel yakalama antikorları bağlayan bu polimer, duyarlı bir yayın arabellek tedavi dekolmanı sağlam hücre (CellCollector DC03 için aygıtı olarak da adlandırılır) izin olduğunu. Yeni functionalized aygıt, hedef hücre kanser hücre satır hücrelerini sığır serum albumin (BSA) çivili çeşitli konsantrasyonları yalıtım sağlar / fosfat tamponlu tuz (PBS) ve periferik kan, anılan sıraya göre.
Üstünde belgili tanımlık aygıt ve kurtarma sonra hücre görsel algılama kolaylaştırmak için hedef kanser hücrelerinin carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) ve kurtarma tedavi öncesi bir DNA leke etiketli (i.e. şarj ve ayırma). Tek hücre DNA kalitesi üzerinde tedavi etkileri sonra WGA bir kalite kontrol PCR4,5aracılığıyla, dizi-CGH6,7 daha önce değerlendirildi ve sıralama7 fark gösterilen hedef tedavi olmayan hücreleri micromanipulated için hücre süspansiyonlar7karşılaştırıldığında. Bu yöntemin avantajı hücreleri tek hücre aşağı akım analizi (şekil 1) için kurtarma ve nadir hedef hücre ön zenginleştirme kombinasyonu yatıyor. Geçerli CE etiketli vivo koleksiyonu aygıtı genellikle CTCs numaralandırılmasına için değil tek hücreli moleküler karakterizasyonu2,8için kullanılır. Ancak, CTCs arasında heterojenite araştırmak için daha kapsamlı bir analiz analizi tek hücre düzeyinde (hedefYani sıralama tek hücre düzeyinde) için uzun. Diğer hücre tabanlı yöntemleri immunomagnetic yalıtım EpCAM pozitif CTCs ve daha sonraki moleküler genetik analiz9,10dielectrophoresis göre tek hücreli işleme, temel alır. CTCs moleküler karakterizasyonu bir klinik ortamda yararlı uygulamaları için önemli bir gereksinimdir ve metastatik cascade temel araştırmada aynı derecede önemlidir. DNA analizi ile en az teknik yalıtım yordamlar11,12tümör yükünün izin verdiği için CTCs paralel olarak büyük önem dolaşımdaki tümör DNA (ctDNA) haline gelmiştir. Hücre tabanlı yaklaşımlar tamamlayıcı bir katkı olarak hizmet verebilir, RNA13,14 ve protein15 ifade analizi için izin verdiği ve CTC için hücre kültürleri veya xenografts16, da elde 17. her ne kadar düşük hücre kurtarma ve hastalarda kullanım için izin gibi engeller hala aşılması gereken, yakalamak ve yöntem serbest nadir hedef hücrelerin karakterizasyonu doğru önemli bir sonraki adım alır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Açıklanan Protokolü (aygıtı olarak adlandırılır) bir functionalized tel ex vivo tek hücreli genom analizi için hücreleri almak amaçlamaktadır. Biz üç EpCAM pozitif hücre hatları (HT-29, LNCaP ve VCaP) test, ama prensip olarak, bu yöntem EpCAM ifade herhangi bir hücre kültürünü uygulanabilir. EpCAM pozitif hedef hücreler için aygıtı saf hücre süspansiyon olarak sunulan (2.1 bkz.) veya karma bir fazlalık arka plan hücre içine (e.g. periferik kan, 2.2 bkz.). Özellikle ikinci yalıtım kapasiteleri nadir hücre koşullar altında test etmek için kullanılabilir, ancak, kabloya bağlı hücre sayısı ince ayar yapılabilir açıklanan düşük hacimli kullanarak yaklaşım (2.3 bkz.). Hücre hatları arasındaki farklar beklenen gibi Tel, rotasyon şarj etmek için uygun hücre yoğunluğu kuluçka süresi bir ayirt mikroskop kullanarak bağlı hücre sayısı değerlendirerek ampirik olarak test edilmesi gerektiği de hız.
Tek hücre düzeyinde WGA genomik aşağı akım uygulamaları için gereklidir. WGA yönteminin seçimi labs arasında farklı olabilir ve prensip olarak, bizim yöntem Embriyolardan veya lazer mikrodiseksiyon elde edilen örnekler işleyebileceğinden daha bütün yöntemler açıktır. Bu protokol için bir ısı-parçalanma temel WGA7kıyasla daha iyi bir performans nedeniyle enzimatik parçalanmış DNA esas alarak bir yöntemini kullanın. İsteğe bağlı, tek hücre izotermal WGA için sonraki DNA20,21profil oluşturma izin iletilebilir.
Açıklanan protokol functionalized teller yeni nesil genomik tek hücre analizi için bağlı sonra sağlam hücreleri kurtarma amaçlamaktadır. Aynı zamanda yalnızca CE onaylı vivo içinde zenginleştirme cihazlar piyasada defa temsil, functionalized teller ilk nesil metastas kanserli hastalarda CTCs numaralandırmak için kullanılmıştır. Önceki yayın ve kendi veri geçerli altın standart teknoloji2ile karşılaştırıldığında daha duyarlı olması için in vivo yalıtım tekniği öneririz. Böylece, belgili tanımlık aygıt içinde fark gibi bu vivo içinde yalıtım teknik bir kurtarma özelliği ile donatılması karakterizasyonu tek hücre düzeyinde yüksek CTC kurtarma birleştirme sağlar.
Ancak, aygıt hastalarda kullanım için temizlenmez, böylece, klinik veri mevcut değildir. Ex vivo uygulamalar (Yani CTCs periferik kan örnekleme sonra izole) teknoloji boşuna (olasılığını artırma ile kübital boşuna, örneğin düşük çap mevcut ayarları adapte olduğu gibi tavsiye edilmez CTCs ve alıcı antikor arasındaki temas doğrudan) ve uzun tutma zamanı (30 dk, kan için 2-3 tel geçmek L izin). Ancak, Seviyelendirilmiş içinde bölüm olarak 2.2. hedef hücreleri de karma örnekleri7‘ den ayrılmış olabilir.
Bir geçerli yöntem sabitlenmemiş hücrelerin verimsiz kurtarma dekolmanı teller üzerinden sonra kısıtlamasıdır. Bu, ancak, dekolmanı tedavi öncesinde bir hücre fiksasyon adım tarafından geliştirilmiş.
Özet olarak, bu iletişim kuralı genetik olarak karakterize tek hücre için hücre kurtarma bir vivo içinde yalıtım tekniği kombine kullanımı ilk adımdır. Daha fazla çaba hücre kurtarma ve izin kendi uygulamasında hasta1,2için en iyi duruma getirme adresi gerekir. Ancak, tedavi izleme ve tedavi kararları için kişiselleştirilmiş tıp CTCs numaralandırma olduğunu. Böylece, bu yöntem genomik CTC karakterizasyonu tek hücre düzeyinde doğru bir ilk adımdır.
Sağlam hücre hasat gibi tek hücreli transcriptome analiz doğru uygulamalar mümkün gibi görünüyor. Ancak, bu kurtarma yordamı RNA bütünlüğü (doğrudan lizis RT-qPCR22tarafından takip kurtarılan tek hücrelere iletmeörneğin ) etkiler olup olmadığını tespit edilebilir kalır. Eğer başarılı olursa, tek hücreleri (örneğin CTCs) karakterizasyonu daha detaylı analizler izin transcriptome seviyeye kaymıştır. Bu konuda, RNA-seq akıllı-seq2 kullanarak değerli bir araç (RNA-seq Kütüphane hazırlık sırasında elde edilen) preamplified cDNA kantitatif PCR için tabi olarak kadar RNA tek hücreleri aşağı akım analizi için sağlar. Bu bir kombine hedef ve tarama tabanlı analiz tek kurtarılan hücreleri22,23sağlayacaktır.
Geçerli functionalized teller CTCs24pozitif seçim için yaygın olarak kullanılan bir epitel belirtecidir anti-EpCAM antikorlar temel alır. Birkaç CTCs cytokeratins veya EpCAM25gibi tümleyici epitel işaretleri kadar antikor gibi HER2/yeni ekleme CTC yalıtım şansını artırmak. Birkaç antikor stratejiler geliştirdi ve Ferreira ve arktarafından gözden zenginleştirme dayalı. 2016 yılında26. Bir tel üzerinde immobilize antikorlar karışımı daha yüksek bir sayı yalıtım ve ek alt türlerinden CTCs önde gelen teknoloji gelecekte bir gelişme olabilir.
Bu çözümde işlevselliğini korumak için su altında tel fonksiyonel tutmam için işleme tel içeren tüm adımları için zorunludur. Tel 1 x PBS değerlendirme sırasında (mikroskop; yerleştirmek için tavsiye e.g. 3.1 adımlar. -3.3.) ve depolama. Uygunsuz boyama önlemek için taze kullanılarak hazırlanan boyama çözüm adımları 1.2.1 öneririz. ve 1.2.2. Zayıf lekeli hücreleri cep tel üzerinde sayma engel ve ekli hücreleri küçümseme için yol açabilir.
Pasteur pipet kauçuk kapaklı tel Pasteur pipet sonraki yükleme hücre süspansiyon (Adım 2.3.4.) eklerken takmayı önlemek gereklidir. Kauçuk kapak böylece fonksiyonel bölümü Pasteur pipet ucu içinde yer alan Tel tutmak için kullanılır. Kap için Pasteur pipet arka çok sıkıca bağlıysa, hücre süspansiyon yüklenmesini mümkün değildir. Bu durumda, öyle ki dolu hücre süspansiyon tarafından zorla göç ettirilmiş havada pipet bırakabilirsiniz kap kolaylaştırmak.
Tel bükme yönünü sırasında adımları 3.2 sayma hücre için çok önemlidir. ve 3,3. Öyle ki bir yana yatmak tel işlevsel olmayan sonu geliyor yapışkan bant kullanarak Tel bağlayın. Fonksiyonel Bölümü’nün tüm uzunluğu taramadan sonra diğer yarısı fonksiyonel tel taranabilir böylece tel 180 ° döndürülür. Bu adım hücreleri tel üzerinde değerlendirmek İlk deneyler için önemlidir. Hücreleri belirli bir hücre kültürünü ve yordam için değerlendirilir sonra yordamı Hücre sayımı olmadan tekrar edilebilir (örn. sadece hücrelerin varlığı için kontrol veya bu adım atlama). Dikkatli pipetting süpernatant adım 4,8 hacmi azaltarak hücre kaybı önlemek çok önemlidir. Sorunsuz turbulences Pelet için neden olmadan yapılır pipetting emin olun.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada Avusturyalı Bilim Fonu (FWF tarafından), proje no finanse edildi. Ben 1220-B19 içinde translasyonel kanser araştırma (TRANSCAN) “Circulating tümör hücreleri biyomarker prostat kanseri (CTC-tarama) Minimal rezidüel hastalığı olarak” ERANET projenin parçası olarak (PS için). Doktora adayı S.C. doktora programı moleküler tıp tıbbi Graz Üniversitesi çerçevesinde eğitim gördü. Yazarlar uzman teknik yardım minnetle Nina Schlögl, Daniel Kummer, Gabi Wendt, Claudia Chudak, Julia Schulz ve Johanna Schiller kabul edersiniz. Yazarlar Georg Peinhaupt grafik tasarım destek için teşekkür ederiz.
Materials
| Gilupi Release Buffer | Gilupi | GIL083 | Used to detach cells from the wire |
| McCoy's 5A Medium (1x) suppl. with L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 16600-082 | Culture medium used for HT-29 cells, adapt culture medium to cell line used for the experiments |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | PAA | S11-001 | Supplement for McCoy's 5A Medium |
| Foetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 | Supplement for McCoy's 5a Modified Medium |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Biowest | L0018-100 | Supplement for McCoy's 5a Modified Medium |
| Phosphate Buffered Saline (1x PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-015 | |
| Accutase | Biowest | L0950-100 | Cell detachment solution (cell culture) |
| Water bath | GFL | Type 1003 | Used for prewarming solutions |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Used to incubate cells (cell culture) | |
| 50 mL reaction tubes | VWR | 525-0403 | |
| Roller mixer | Stuart Scientific | SRT6D | Used to attach cells to the wire while keeping the cells from sedimenting |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher Scientific | C34554 | Used to label living cells (cytoplasmic label) |
| Hoechst 33342 | H3570 | Thermo Fisher Scientific | Used to stain DNA (nucleic counterstain) |
| Centrifuge (equipped for holding 15 mL and 50 mL reaction tubes) | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Megafuge 40R | Used for pelleting cells |
| Observer Z1 (Fluorescence/laser microdissection microscope) | Carl Zeiss Microimaging | Inverted (immunofluorescence) microscope capable of laser microdissection; Fluorescence microscopes must be able to detect Hoechst 33342 (DAPI filter) and CFSE (FITC filter) | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | Used for coating glass/plastic surfaces |
| MS1 Minishaker | Sigma-Aldrich | Z404039 | Used for vortexing |
| Vacutainer EDTA (or Na-heparin) tubes | BD | 366450 (or 366480) | Used as reaction tube for ex vivo capture of target cells |
| Detektor CANCER03 DC03 | Gilupi | GIL003 | Functionalized wire capable of isolating and detaching EpCAM-positive cells (also referred to as catch&release, C&R) |
| Syringe needles (G20) | VWR | 613-0554 | Used to puncture rubber caps in order to allow the non-functional part of the C&R to lead through it |
| Neubauer chamber | Roth | T729.1 | Used to count cells |
| Pasteur pipettes 150 mm | Volac | D810 | Used for the low-volume application of cells to the C&R |
| Grease pen | Dako | S2002 | Used on glass slides to hold cell suspension in place |
| Steril syringe filter (0.2 µm) | Corning | 431219 | For filtering freshly prepared Gilupi Release Buffer |
| Delfia PlateShaker | Perkin Elmer | 1296-003 | Used for agitation during cell detachment |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 30,125,150 | |
| Ampli1 WGA Kit | Silicon Biosystems | To be ordered via Silicon Biosystems | |
| Axiovert M200 equipped with Mikromanipulator MMJ and CellTram vario | Zeiss/Eppendorf | Use micromanipulation at hand | |
| Microcapillaries (25 µm in diameter), CustomTip Type I | Eppendorf | 930001201 | Used for micromanipulating cells |
| 0.2 mL PCR tubes | Biozym | 710920 | |
| Cytocentrifuge and equippment | Hettich | Universal 32 | Use cytocentrifuge at hand |
| Thermo cycler | Bio-Rad | DNA Engine Dyad | Every thermo cycler with heated lid can be used |
| Microcentrifuge | Roth | CX73.1 | Use desk-top centrifuge at hand |
| MembraneSlide 1.0 PET | Zeiss | 415101-4401-050 | Membrane-coated glass slides used for laser microdissection |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | Use DNA cross linker at hand |
| Standard PCR reagents | |||
| 6x DNA Loading | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Use gel loading dye at hand |
| DNA ladder | BioLabs | N0551G | Use 100 bp ladder at hand |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Gel electorphoresis station | Bio-Rad | Use electrophoresis system at hand | |
| Gel Red Nucleic Acid Stain | Biotium | 41003 | Intercalating dye for DNA visualization In agarose gels |
References
- Saucedo-Zeni, N., et al. A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire. Int J Oncol. 41 (4), 1241-1250 (2012).
- Gorges, T. M., et al. Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells. Clin Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).
- Kuske, A., et al. Improved detection of circulating tumor cells in non-metastatic high-risk prostate cancer patients. Sci Rep-UK. 6 (1), (2016).
- van Beers, E. H., et al. A multiplex PCR predictor for aCGH success of FFPE samples. Brit J Cancer. 94 (2), 333-337 (2006).
- El-Heliebi, A., Chen, S., Kroneis, T. Using Multiplex PCR for Assessing the Quality of Whole Genome Amplified DNA. Methods Mol Biol. 1347, 119-128 (2015).
- Möhlendick, B., et al. A Robust Method to Analyze Copy Number Alterations of Less than 100 kb in Single Cells Using Oligonucleotide Array CGH. PLoS ONE. 8 (6), e67031 (2013).
- Chen, S., et al. Catch and Release: rare cell analysis from a functionalised medical wire. Sci Rep-UK. 7, 43424 (2017).
- Zhang, H., et al. Enumeration and molecular characterization of circulating tumor cell using an in vivo capture system in squamous cell carcinoma of head and neck. Chin J Cancer Res. 29 (3), 196-203 (2017).
- Carter, L., et al. Molecular analysis of circulating tumor cells identifies distinct copy-number profiles in patients with chemosensitive and chemorefractory small-cell lung cancer. Nat Med. 23 (1), 114-119 (2017).
- Luca, F. D., et al. Mutational analysis of single circulating tumor cells by next generation sequencing in metastatic breast cancer. Oncotarget. , (2016).
- Aravanis, A. M., Lee, M., Klausner, R. D. Next-Generation Sequencing of Circulating Tumor DNA for Early Cancer Detection. Cell. 168 (4), 571-574 (2017).
- Page, K., et al. Next Generation Sequencing of Circulating Cell-Free DNA for Evaluating Mutations and Gene Amplification in Metastatic Breast Cancer. Clin Chem. 63 (2), 532-541 (2017).
- Kalinich, M., et al. An RNA-based signature enables high specificity detection of circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma. P Natl Acad Sci USA. 114 (5), 1123-1128 (2017).
- Gorges, T. M., et al. Accession of Tumor Heterogeneity by Multiplex Transcriptome Profiling of Single Circulating Tumor Cells. Clin Chem. 62 (11), 1504-1515 (2016).
- Sinkala, E., et al. Profiling protein expression in circulating tumour cells using microfluidic western blotting. Nat Commun. 8, 14622 (2017).
- Morrow, C. J., et al. Tumourigenic non-small-cell lung cancer mesenchymal circulating tumour cells: a clinical case study. Ann Oncol. 27 (6), 1155-1160 (2016).
- Williamson, S. C., et al. Vasculogenic mimicry in small cell lung cancer. Nat Commun. 7, 13322 (2016).
- Czyż, Z. T., Stoecklein, N. H., Polzer, B. Laser Microdissection of FFPE Tissue Areas and Subsequent Whole Genome Amplification by Ampli1TM. Methods Mol Biol. 1347, 141-162 (2015).
- Czyż, Z. T., Klein, C. A. Deterministic Whole-Genome Amplification of Single Cells. Methods Mol Biol. 1347, 69-86 (2015).
- Kroneis, T., et al. Automatic retrieval of single microchimeric cells and verification of identity by on-chip multiplex PCR. J Cell Mol Med. 14 (4), 954-969 (2010).
- Kroneis, T., et al. Combined Molecular Genetic and Cytogenetic Analysis from Single Cells after Isothermal Whole-Genome Amplification. Clin Chem. 57 (7), 1032-1041 (2011).
- Kroneis, T., Jonasson, E., Andersson, D., Dolatabadi, S., Ståhlberg, A. Global preamplification simplifies targeted mRNA quantification. Sci Rep-UK. 7, 45219 (2017).
- Picelli, S., Faridani, O. R., Bjorklund, A. K., Winberg, G., Sagasser, S., Sandberg, R. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).
- El-Heliebi, A., Heitzer, E., Kroneis, T., Chen, S., Haudum, C., Fuchs, J. Potential and Challenges of Liquid Biopsies. Mechanisms of Molecular Carcinogenesis. 2, 233-261 (2017).
- Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (3), 178-196 (2014).
- Ferreira, M. M., Ramani, V. C., Jeffrey, S. S. Circulating tumor cell technologies. Mol Oncol. 10 (3), 374-394 (2016).
