Purificación de ADN Viral para la identificación de las proteínas virales y celulares asociadas
Summary
El objetivo de este protocolo es específicamente la etiqueta y aislar selectivamente la DNA viral de células infectadas para la caracterización de proteínas del genoma viral asociado.
Abstract
El objetivo de este protocolo es para aislar el virus del herpes simple tipo 1 (HSV-1) DNA de las células infectadas para la identificación de asociado viral y celulares proteínas por espectrometría de masas. Aunque proteínas que interaccionan con genomas virales desempeñan un papel importante en determinar el resultado de la infección, un análisis exhaustivo de las proteínas del genoma viral asociado no era previamente posible. Aquí nos muestran un método que permite la purificación directa de los genomas de HSV-1 de las células infectadas. Replicación de ADN viral selectivamente se etiqueta con nucleótidos modificados que contienen un grupo funcional de alquino. Etiquetado ADN es entonces irreversible y específicamente etiquetada vía el accesorio covalente de la azida de biotina través de cobre (I)-catalizado reacción de cicloadición o clic de azida-alquino. DNA etiquetados biotina es purificado en bolas recubiertas de estreptavidina y las proteínas asociadas son eluidas identificadas por espectrometría de masas. Este método permite la focalización selectiva y el aislamiento de las horquillas de replicación de HSV-1 o genomas enteros de entornos biológicos complejos. Además, la adaptación de este enfoque permitirá la investigación de diversos aspectos de la infección herpética, así como el examen de los genomas de otros virus ADN.
Introduction
Virus tienen una capacidad limitada para realizar las funciones esenciales y por lo tanto depende de factores del anfitrión para facilitar los aspectos más importantes de infección que incluye transporte, replicación, reparación, recombinación y expresión génica viral. Las actividades de estos factores de host están a menudo aumentadas por proteínas virally codificadas. Además, el virus deben evitar detección e interferencia por respuestas celulares a la infección viral. Por lo tanto, las interacciones host de virus determinan el resultado de la infección. De primordial importancia es entender cómo virus alteran el ambiente celular para adaptar la maquinaria celular para facilitar procesos virales. De particular interés es identificar qué factores y procesos que actúan sobre genomas virales durante todo el ciclo infeccioso.
Herpes simplex virus tipo 1 (HSV-1) es que un doble trenzado DNA virus que infecta una parte sustancial de la población humana. En la primera hora de la infección, el genoma viral entra en el núcleo, donde una cascada de pedidos de la expresión génica viral sobreviene en coordinación con el viral de replicación de ADN (vDNA)1. En el núcleo, genomas están sujetas a regulación epigenética, se someten a reparación y recombinación y se empaquetan en la cápsida, que los primeros viriones de progenie se producen en menos de seis horas. La evaluación integral de las proteínas del genoma viral asociado a través del curso de la infección será sentar las bases para investigar los detalles moleculares de los procesos que actúan en genomas virales y se proporcionan la penetración en qué factores virales y celulares participan en distintas etapas de la infección.
Los métodos anteriores para la investigación de factores de huésped implicados en la infección viral incluyen la purificación de la afinidad de las proteínas virales para el análisis de las proteínas celulares asociadas2,3,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9. estos ensayos han sido instrumentales para la identificación de los factores celulares implicados en las respuestas antivirales host, así como modificación de la cromatina viral, la expresión génica, y reparación del ADN. Sin embargo, es difícil determinar si las interacciones dependen de la asociación con vDNA y proteómica sólo proporciona la penetración en las interacciones que se producen en función de un factor viral específico. Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) se ha utilizado para identificar donde se unen las proteínas virales y celulares específicas a genomas virales10,11,12,13,14 , 15 y la hibridación in situ fluorescente (FISH) combinado con inmunocitoquímica ha permitido la visualización de los factores celulares que colocalize con vDNA16,17,18, 19 , 20. estos ensayos permiten análisis espacial y temporal. Sin embargo, limitaciones incluyen la necesidad de anticuerpos altamente específicos, sensibilidad limitada y la necesidad de la visión anterior de las interacciones host de virus. Por lo tanto hemos desarrollado un método basado en iPOND (aislamiento de proteínas de ADN naciente)21 y aniPOND (acelerada nativa iPOND)22 selectivamente etiqueta y purificar vDNA de infectado las células para la identificación objetiva de genoma viral proteínas asociadas por espectrometría de masas. iPOND ha sido fundamental para la investigación de la dinámica de la bifurcación de replicación celular.
Para la purificación selectiva de los genomas virales de las células infectadas, replicar vDNA está etiquetado con nucleósidos ethynyl modificado, 5-ethynyl-2´-desoxiuridina (EdU) o 5-ethynyl-2´-desoxicitidina (EdC) (figura 1), seguido de covalente verbal a azida de biotina a través, haga clic en química para facilitar la purificación del solo paso de genomas virales y las proteínas asociadas en bolas recubiertas de estreptavidina (figura 2B). Lo importante, las infecciones se llevan a cabo en las células fijas, que no participan en la replicación del ADN celular para permitir el etiquetado específico de vDNA. Además, la infección HSV-1 causa la detención del ciclo celular e inhibe celular ADN replicación23,24. Virus puede ser prelabeled antes de la infección para el análisis de proteínas relacionadas con genomas virales entrantes (figura 1A) o marcado durante la replicación del ADN para el análisis de proteínas relacionadas con vDNA recién sintetizada (figura 1B) 25. Además, los análisis de chase de pulso pueden utilizarse para investigar la naturaleza de las proteínas asociadas con la replicación viral las horquillas (figura 1)26. Además, vDNA ethynyl-modificado puede ser covalentemente conjugado con un fluoróforo de investigación espacial de la dinámica de la proteína (figura 2A y figura 3). La proyección de imagen permite la visualización directa de vDNA es un método gratuito para la validación de las interacciones vDNA-proteína y puede ser adaptada para rastrear genomas virales a lo largo de la infección. Esperamos que estos enfoques podrían modificarse aún más para el estudio de cualquier aspecto de la infección herpética, incluyendo latencia y reactivación y para el estudio de otros virus ADN. Por otra parte, etiquetado con uridina 5-ethynyl (UE) podría permitir el análisis de genomas virales de RNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo incluye varios pasos que, si no siguen cuidadosamente, pueden resultar en rendimiento de proteína redujo significativamente o contaminación con el ADN celular. Es esencial que las células fijas se utilizan para todos los experimentos para asegurar que el ADN celular no es etiquetado y purificada. Esto puede confirmarse por la ausencia de polimerasas de la DNA celulares en la muestra de proteína debido a HSV-1 no utilizar celular polimerasa de la DNA para la síntesis del genoma. EdC etiquetado y núcle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos Hannah Fox para ayuda en la preparación de este manuscrito. Este trabajo fue financiado por los NIH grant R01AI030612.
Materials
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-082 | substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate |
| 600 cm2 tissue culture dish | Thermo Fisher Scientific | 166508 | |
| Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4 | 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine | ||
| HSV-1 stock | stocks with titers greater than 1×109 PFU/mL work best | ||
| Sephadex G-25 column (PD-10 Desalting Column) | GE Healthcare | 17085101 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-1 | |
| 5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) | Sigma-Aldrich | T511307 | Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| 2´-deoxycytidine (deoxyC) | Sigma-Aldrich | D3897 | Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| Nuclear Extraction Buffer (NEB) | prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal) | ||
| Cell scraper | Bellco glass | 7731-22000 | Autoclave before use |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS, pH 7.2 (10x) | 1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use) | ||
| Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O) | Fisher Scientific | C489 | Prepare 100 mM stock and store at 4 °C for up to 1 month |
| (+) Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use |
| Biotin azide | Invitrogen | B10184 | Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 °C for up to 1 year |
| Click Reaction Mix | prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate) | ||
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 °C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer |
| freezing buffer | prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease inhibitor) | ||
| Buffer B1 | prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B2 | prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B3 | prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor) | ||
| Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe | Sonics | VCX 130 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Life Technologies | 65601 | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 260750F | |
| 2X Laemmli sample buffer | Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4 °C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM. | ||
| cap locks for 1.5 mL tube | Fisher Scientific | NC9679153 | |
| Standard western blotting reagents | |||
| NOVEX Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| 12-well tissue culture dish | Corning | 3513 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-100 | Autoclave before use |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-5 | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | dilute to 3.7% in 1x PBS before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 | prepare 3% in 1x PBS |
| Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100) | Sigma-Aldrich | T8787 | prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS |
| Click reaction cocktail – Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Molecular Probes | C10337 | prepare according to manufactorer's protocol |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 °C for up to 1 year |
| mouse anti-ICP8 primary antibody | Abcam | ab20194 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| mouse anti-UL42 primary antibody (2H4) | Abcam | ab19311 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody | Life Technologies | a11005 | Use a 1:500 dilution in 1x PBS |
| Immu-mount | Thermo Fisher Scientific | 9990402 | |
| 2x SDS-bicarb solution | 2% SDS, 200 mM NaHCO3 | ||
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 °C in the dark | ||
| chloroform:isoamyl alcohol | mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark | ||
| 10x Tris EDTA (TE), pH 8.0 | 100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use) | ||
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| 3 M sodium acetate pH 5.2 | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Fluorescence microscope equipped with imaging software | |||
| Microcentrifuge for 1.5 mL tubes | |||
| Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes | |||
| Cell culture incubator | |||
| Biosafety cabinet | |||
| Heat blocks | 65 °C and 95 °C |
References
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