リアルタイム揺れる誘起変換用糞便材料の CWD プリオンの検出

プリオン病または伝染性海綿状脳症 (TSE) は、牛海綿状脳症 (BSE) 牛、スクレイピー羊とヤギ、無駄に慢性的な人間のクロイツ フェルト ・ ヤコブ病 (CJD) を含む神経変性疾患シカ科^1,2病 (CWD)。Tse は、特徴的な海綿状外観と脳のニューロンの損失によって特徴付けられます。「タンパク質のみ」の仮説によれば、プリオンは主に PrP^Sc (スクレイピーの ‘ Sc’) ³、PrP^Cホストでエンコードされたプリオン蛋白変性アイソ フォーム成る。PrP^Scは PrP^Cのバインドし、他の PrP^C分子に変換するシードとして機能できる ᵦ シート^4,5,6の濃縮形態への変換に起因します。新しく生成された PrP^Sc分子は小さいオリゴマー、感染核の高い数値で結果に分解成長ポリマー ^7、8に組み込まれます。PrP^Sc集計しやすいプロテアーゼ^9,10に部分的に耐性があります。

CWD に影響を与える野生と養殖のエルク (Cervus canadensis)、ミュールジカ (ジューテリウム ドルノゴビ)、オジロジカ (WTD;ジューテリウムで子鹿) (Alces alces) ムースやトナカイ (となかい座 tarandus tarandus) ^11,12,13。それはシカの相互作用と感染^14,15の環境の永続性によって支持される水平伝播と最も伝染のプリオン病と見なされます。その他プリオン PrP^Sc蓄積と感染が脳に限られているとは異なり CWD にこれらにも、末梢組織や体液など唾液、尿、糞便^16,17,18。

免疫組織化学は、CWD PrP^Sc分布と海綿状病変^19,20を検出する診断のゴールド スタンダードと見なされます。ELISA よりまれに、西部のしみ CWD 診断に使われまた。したがって、現在のプリオン病の診断は主に事後組織でプリオンを検出に基づいています。CWD の殺診断は、扁桃腺や直腸肛門粘膜関連リンパ組織 (RAMALT) バイオプシー;ただし、このプロシージャは侵襲性があり、動物の捕獲が必要です。したがって、尿や糞便などの簡単にアクセスできる検体の使用は、CWD プリオン検出のための実用的な方法でしょう。しかし、これら糞尿港プリオン現在診断法の検出限界値以下の濃度が比較的低い。その結果より高感度・高スループットの診断ツールが必要です。変換システムの in vitroタンパク質フォールディング繰返し増幅など分析 (PMCA) ²¹、アミロイド播種法とリアルタイムで揺れる誘起変換 (RT QuIC) 試金^22,23,24はプリオン変換プロセス体外を模倣する PrP^Scの自己増殖する能力を悪用し、それによりごく微量検出レベル^{25 に PrPScの存在を増幅する非常に強力なツール ,26}。RT QuIC 法はただし、変換製品の β シートの二次構造の濃縮が thioflavin T (Th T) をバインドできる具体的事実を活用します。したがって、組み換え PrP (rPrP) シードの変換時に、バインド Th T と、検出できるリアルタイムで Th T 時間をかけて相対的な蛍光ユニット (RFU) として表現の蛍光を測定することによってアミロイド線維に生えています。監視、RFU は相対的な播種活動と遅れ位相など定量的パラメーターを評価する使用できます。遅れ位相は、どの rPrP Th T 蛍光の検出限界値以下は反応の早い段階で変換のしきい値に到達するために必要な時間 (h) を表します。明らかラグの段階では、十分なアミロイド核 (核/伸び) の形成に付随の終わりは、Th T 蛍光閾値レベルを超えているし、ポジティブになるときに発生します。アミロイド線維は実際の時間と初期の PrP^Scやサンプルに含まれているシードの活動で検出できるの成長はより多くの種を生成するセグメンテーションによって増幅されます。これらの種は順番、アミロイド線維の成長の急速な指数段階を誘発します。

この試金は低 1 として検出することができるので PrP^{Sc 24}fg、感度の高い資格様々 な末梢組織、排泄物や他の PrP^Scを検出することにより、事前事後分析や非侵襲的診断を達成するためにこのテクニック感染性の低レベルをかくまっている標本の種類。RT QuIC 再現性、実用性、速さ (50 h 未満)、生物検定と比較して低コストで他のアッセイの利点を間違いなく提供します。PMCA; で使用される超音波処理など技術的な複雑さを回避します。また、各ウェルのエアロゾル汚染の危険性を最小にするテープ ・ シールのマイクロ プレートでそれを行います。複数井戸のフォーマット実験では同じ最大 96 サンプルの解析が可能。 にします。偽陽性の問題を再発と生体外の試金の変換 rPrP の自発的な転換に対抗するには、RT QuIC でしきい値 (カットオフ) の実装に便利です。確かに、ネガティブ コントロール (否定的なサンプル +5 SD ²⁷の平均 RFU) の結果に基づき、基準を設定するから正と負のサンプル間の差別を行うことができます。各サンプルの 4 つの複製の使用はこうして複製の少なくとも 50%、肯定的な信号を示すとき肯定的なサンプルの定義に助けることができる、すなわちカットオフ²⁸を渡ります。例えば以前の研究ではハムスター rPrP 発見されたヒトの PrP^vCJDの相同の基板と比較してより敏感な基板にシードし、羊スクレイピー シード反応^{、RT-QuIC でシードと基板との間の相同性は必要ありません。29}. ハムスター羊キメラ rPrP も人間 rPrP ³⁰人間バリアント CJD プリオンを検出するよりもより適して基板に示唆されました。したがって、rPrP 基板上の異なる種からの使用は、この試金で非常に一般的です。この試金は散発的な CJD ^31,32,33, gen などのいくつかのプリオン病に正常に適用されています。エティックのプリオン疾患³⁴BSE ^35,36,37、スクレイピー ^23,36,^40,4139,CWD ^38、、^{、 42}。用いた研究処理髄液、全血、唾液、尿 RT QuIC で種子が^40,4139,PrP^{Sc 38、}、^、を検出するすべての成功したも⁴²アミロイド線維形成阻害剤を含む血漿などのサンプルで検出能力を育成する Orrú et al.。(2011)^Scの PrP の免疫沈降 (IP) ステップと RT quic 社によるアミロイド線維形成阻害剤を削除するための戦略を開発、「quic 社強化」の試金 (eQuIC) の名前。さらに、基板交換の手順は、感度を向上させるために反応時間 〜 24 時間後採用されました。最終的には、として低 1 として PrP^Scの ag eQuIC ³⁰によって検知されました。

糞便抽出物を浄化し、糞便中に可能なアッセイの阻害剤を削除、するために糞便経口感染実験にエルクから前臨床、臨床段階で収集された洗剤とプロテアーゼ阻害剤を含むバッファーで均質化されました。糞便抽出物は、ナトリウム リンタングステン酸アルゼンチンタンゴダンスプロフェッショナル降水による蛋白質の沈殿物を利用したサンプルの PrP^Scを集中する異なる方法論をさらに堤出されました。最初 Safarらによって記述された NaPTA 沈殿法⁴³, を使用して、テスト サンプルに PrP^Scを集中します。PrP^Cよりもむしろ PrP^Scの優遇の沈殿物のサンプルの結果と NaPTA のインキュベーション。ただし、分子メカニズムはまだ明らかではありません。このステップはまたを含む、いくつかのケースで観察される rPrP の自発的な変換を防ぐことを助けた。最後に、糞便抽出物は、最適化された RT-QuIC 基板としてマウス rPrP (aa 23-231) を使用して、プロトコルに基板交換を含む検出の感度を改善するために、テストされました。

ここでの結果は、この改良法 CWD プリオンの非常に低い集中を検出することができますなり、検出と糞便 NaPTA 降水量と基板交換せずプロトコルと比較して特異性の感度を示します。このメソッドは、可能性のある他の組織や体液に適用することができます、野生と飼育下のシカ科の CWD 監視のための偉大な使用することができます。