Single-molecuul manipulatie van G-quadruplexes door magnetische pincet
Summary
Een single-molecuul magnetische pincet platform te manipuleren van de G-quadruplexes is gemeld, waardoor voor de studie van G4 stabiliteit en verordening door verschillende eiwitten.
Abstract
Niet-canonieke nucleïnezuur secundaire structuur die g-quadruplexes (G4) zijn betrokken bij diverse cellulaire processen, zoals DNA-replicatie, transcriptie, RNA verwerking en telomeer rek. Tijdens deze processen, verschillende eiwitten binden en lossen G4 structuren voor het uitvoeren van hun functie. Als de functie van de G4 is vaak afhankelijk van de stabiliteit van de gevouwen structuur, is het belangrijk om te onderzoeken hoe G4 bindende eiwitten reguleren de stabiliteit van de G4. Dit werk presenteert een methode om te manipuleren enkel G4 moleculen met behulp van magnetische pincet, waarmee studies van de regulering van de G4 bindende proteïnen op een enkel molecuul van de G4 in real-time. In het algemeen, is deze methode geschikt voor een breed toepassingsgebied van applicaties in studies voor eiwitten/ligand interacties en verordeningen bij verschillende DNA of RNA secondaire structuren.
Introduction
Vier-stranded DNA of RNA G4 structuren spelen een kritieke rol in vele belangrijke biologische processen1. Veel eiwitten zijn betrokken bij G4 bindende en verordening, met inbegrip van telomere bindende proteïnen (telomerase, RPA, TEBPs, POT1, TRF2)1,2, transcriptiefactoren (nucleolin, PARP1)3, RNA eiwitten (hnRNP A1, verwerking hnRNP A2)4, helicasen (BLM, FANCJ, RHAU, WRN, Dna2, Pif1)5en DNA-replicatie gerelateerde eiwitten (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. Binding aan eiwitten kan stabiliseren of destabiliseren G4 structuren; dus regelen de volgende biologische functies. De stabiliteit van de G4 werd gemeten door thermische smelten met behulp van ultraviolet (UV) of circulair dichroïsme (CD) methoden7. Dergelijke omstandigheden zijn echter niet fysiologische relevant en moeilijk toe te passen op het bestuderen van de effecten van bindende eiwitten7.
De snelle ontwikkeling van single-molecuul manipulatie technologieën heeft studies van vouwen en ontplooiing van een Biomolecuul, zoals een DNA of een eiwit, op het niveau van een single-molecuul met nanometer resolutie in real-time8ingeschakeld. Atomaire kracht microscopie (AFM), optisch pincet en magnetische pincet zijn de meest gebruikte methoden van de single-molecuul manipulatie. Vergeleken bij de AFM en optisch pincet9, toestaan magnetische pincet stabiele metingen van vouwen-ontvouwen dynamica van een enkel molecuul dagen met behulp van een anti-drift techniek10,11.
Hier is een platform van de single-molecuul manipulatie met behulp van magnetische pincet om te bestuderen van de regulering van de G4 stabiliteit door bindende eiwitten gerapporteerde12,,13. Dit werk beschrijft de fundamentele benaderingen, met inbegrip van de voorbereiding van de steekproef en stroom kanaal, de installatie van magnetische pincet en de kalibratie van de kracht. De controle van de kracht en de protocollen van de anti-drift als beschreven in stap 3 zorgen voor lange tijdmetingen onder verschillende kracht-besturingselementen, zoals constante kracht (force klem) en constante laden stem op (kracht-oprit) en kracht-sprong meting. Kunnen de kracht kalibratie protocol beschreven in stap 4 kracht ijking van < 1 µm korte aanbinden via een breed geldende maximaal 100 pN, met een relatieve fout binnen 10% variëren. Een voorbeeld van regelgeving van de stabiliteit van het RNA Helicase geassocieerd met AU-rijke element (RHAU) helicase (alias DHX36, G4R1), die een essentiële rol bij het oplossen van dat RNA G4 wordt gebruikt om aan te tonen van de toepassingen voor dit platform13speelt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zoals hierboven beschreven, een platform voor de studie van de mechanische stabiliteit van G4 DNA en de interacties van eiwitten voor het gebruik van de G4 wordt single-molecuul magnetische pincet gemeld. Vergezeld van het platform, worden hoogefficiënte protocollen van het vinden van de G4 DNA ketting en meting van de vouwen-ontvouwen dynamiek en stabiliteit van de structuur van de G4 met nanometer speciale resolutie ontwikkeld. Het brandvlak vergrendeling schakelt de zeer stabiele anti-drift-besturing, die belangrijk …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Meng Pan voor proeflezen van het manuscript. Dit werk wordt ondersteund door Singapore ministerie van onderwijs academisch onderzoek Fonds fase 3 (MOE2012-T3-1-001) naar J.Y.; de National Research Foundation via de Mechanobiology Instituut Singapore J.Y.; de National Research Foundation, Prime Minister’s Office, Singapore, onder de NRF Investigatorship programma (NRF Investigatorship Award nr. NRF-NRFI2016-03 tot J.Y.; het fundamentele onderzoeksfonds voor de universiteiten (2017KFYXJJ153) van de centrale naar H. Y.
Materials
| DNA PCR primers | IDT | DNA preparations | |
| DNA PCR chemicals | NEB | DNA preparations | |
| restriction enzyme BstXI | NEB | R0113S | DNA preparations |
| coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm) | BMH.BIOMEDIA | 72204 | flow channel preparation |
| Decon90 | Decon Laboratories Limited | flow channel preparation | |
| APTES | Sigma | 440140-500ML | flow channel preparation |
| Sulfo-SMCC | ThermoFisher Scientific | 22322 | flow channel preparation |
| M-280, paramganetic beads,streptavidin | ThermoFisher Scientific | 11205D | flow channel preparation |
| Polybead Amino Microspheres 3.00 μm | Polysciences, Inc | 17145-5 | flow channel preparation |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250-250ML | flow channel preparation |
| Olympus Microscopes IX71 | Olympus | IX71 | Magnetic tweezers setup |
| Piezo-Z Stages P-721 | Physik Instrumente | P-721 | Magnetic tweezers setup |
| Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X | Olympus | MPLAPON-Oil 100X | Magnetic tweezers setup |
| CCD/CMOS camera | AVT | Pike F-032B | Magnetic tweezers setup |
| Translation linear stage | Physik Instrumente | MoCo DC | Magnetic tweezers setup |
| LED | Thorlabs | MCWHL | Magnetic tweezers setup |
| Cubic Magnets | Supermagnete | Magnetic tweezers setup | |
| Labview | National Instruments | Magnetic tweezers setup | |
| OriginPro/Matlab | OriginLab/MathWorks | Data analysis |
References
- Rhodes, D., Lipps, H. J. G-quadruplexes and their regulatory roles in biology. Nucleic Acids Res. 43 (18), 8627-8637 (2015).
- Brazda, V., Haronikova, L., Liao, J. C., Fojta, M. DNA and RNA quadruplex-binding proteins. Int J Mol Sci. 15 (10), 17493-17517 (2014).
- Gonzalez, V., Hurley, L. H. The C-terminus of nucleolin promotes the formation of the c-MYC G-quadruplex and inhibits c-MYC promoter activity. 生物化学. 49 (45), 9706-9714 (2010).
- Wang, F., et al. telomerase-interacting protein that unfolds telomere G-quadruplex and promotes telomere extension in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), 20413-20418 (2012).
- Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M., Mergny, J. L. G-quadruplexes and helicases. Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).
- Schiavone, D., et al. PrimPol Is Required for Replicative Tolerance of G Quadruplexes in Vertebrate Cells. Mol Cell. 61 (1), 161-169 (2016).
- Lane, A. N., Chaires, J. B., Gray, R. D., Trent, J. O. Stability and kinetics of G-quadruplex structures. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5482-5515 (2008).
- Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing folding energy landscapes by single-molecule force spectroscopy. Annu Rev Biophys. 43, 19-39 (2014).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Chen, H., et al. Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA. Biophys J. 100 (2), 517-523 (2011).
- Chen, H., et al. Dynamics of equilibrium folding and unfolding transitions of titin immunoglobulin domain under constant forces. J Am Chem Soc. 137 (10), 3540-3546 (2015).
- You, H., Wu, J., Shao, F., Yan, J. Stability and kinetics of c-MYC promoter G-quadruplexes studied by single-molecule manipulation. J Am Chem Soc. 137 (7), 2424-2427 (2015).
- You, H., Lattmann, S., Rhodes, D., Yan, J. RHAU helicase stabilizes G4 in its nucleotide-free state and destabilizes G4 upon ATP hydrolysis. Nucleic Acids Res. 45 (1), 206-214 (2017).
- You, H., et al. Dynamics and stability of polymorphic human telomeric G-quadruplex under tension. Nucleic Acids Res. 42 (13), 8789-8795 (2014).
- Fu, H., Chen, H., Marko, J. F., Yan, J. Two distinct overstretched DNA states. Nucleic Acids Res. 38 (16), 5594-5600 (2010).
- Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophys. J. 82 (6), 3314-3329 (2002).
- Fu, H., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
- Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
- Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
- Chen, H., et al. Improved High-Force Magnetic Tweezers for Stretching and Refolding of Proteins and Short DNA. Biophys. J. 100 (2), 517-523 (2011).
- Fu, H. X., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
- Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
- Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
- Vaughn, J. P., et al. The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).
- Giri, B., et al. G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).
- De Vlaminck, I., Dekker, C. Recent advances in magnetic tweezers. Annu Rev Biophys. 41, 453-472 (2012).
- Yan, J., Skoko, D., Marko, J. F. Near-field-magnetic-tweezer manipulation of single DNA molecules. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 70 (1 Pt 1), 011905 (2004).
- Le, S., et al. Disturbance-free rapid solution exchange for magnetic tweezers single-molecule studies. Nucleic Acids Res. 43 (17), e113 (2015).
- Neidle, S. Quadruplex Nucleic Acids as Novel Therapeutic Targets. J Med Chem. 59 (13), 5987-6011 (2016).
- Simone, R., Fratta, P., Neidle, S., Parkinson, G. N., Isaacs, A. M. G-quadruplexes: Emerging roles in neurodegenerative diseases and the non-coding transcriptome. FEBS Lett. 589 (14), 1653-1668 (2015).
- Balasubramanian, S., Hurley, L. H., Neidle, S. Targeting G-quadruplexes in gene promoters: a novel anticancer strategy?. Nat Rev Drug Discov. 10 (4), 261-275 (2011).
- Amato, J., et al. Toward the Development of Specific G-Quadruplex Binders: Synthesis, Biophysical, and Biological Studies of New Hydrazone Derivatives. J Med Chem. 59 (12), 5706-5720 (2016).
- Wells, R. D. Non-B DNA conformations, mutagenesis and disease. Trends Biochem Sci. 32 (6), 271-278 (2007).
