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Abstract
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生物化学

Manipolazione di singola molecola di G-quadruplex di pinzette magnetiche

Published: September 19, 2017
doi:
10.3791/56328
, , , ,
1School of Pharmacy, Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology, 2Mechanobiology Institute,National University of Singapore, 3Department of Physics,National University of Singapore, 4Research Institute for Biomimetics and Soft Matter, Fujian Provincial Key Lab for Soft Functional Materials Research, Department of Physics,Xiamen University, 5Center for Bioimaging Sciences,National University of Singapore

Summary

Una piattaforma di singola molecola magnetico pinzette per manipolare G-quadruplex è segnalata, che permette per lo studio della stabilità di G4 e regolamento di varie proteine.

Abstract

Non-canonico dell’acido nucleico struttura secondaria che g-quadruplex (G4) sono coinvolti in diversi processi cellulari, come ad esempio la replicazione del DNA, trascrizione, elaborazione del RNA e l’allungamento dei telomeri. Durante questi processi, varie proteine legano e risolvere strutture G4 per svolgere la loro funzione. Come la funzione di G4 spesso dipende dalla stabilità della sua struttura piegata, è importante studiare come G4 proteine regolano la stabilità di G4. Questo lavoro presenta un metodo per modificare singole molecole di G4 usando la pinzetta magnetica, che permette studi del regolamento delle proteine leganti G4 su una singola molecola di G4 in tempo reale. In generale, questo metodo è adatto per un ampio campo di applicazioni negli studi per interazioni proteine/ligandi e regolamenti su varie strutture secondarie del DNA o RNA.

Introduction

Quattro-stranded DNA o RNA G4 strutture svolgono un ruolo critico in molti processi biologici importanti1. Molte proteine sono coinvolte nel legame G4 e regolamento, comprese le proteine obbligatorie del telomero (telomerase, POT1, RPA, TEBPs, TRF2)1,2, fattori di trascrizione (nucleolina, PARP1)3, RNA, proteine (hnRNP A1, di elaborazione hnRNP A2)4, elicasi (BLM, Pif1, FANCJ, RHAU, WRN, Dna2)5e replicazione del DNA relative proteine (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. Legame con le proteine può stabilizzare o destabilizzare G4 strutture; regolando le successive funzioni biologiche. La stabilità del G4 è stata misurata da thermal fusione utilizzando raggi ultravioletti (UV) o di metodi di dicroismo circolare (CD)7. Tuttavia, tali condizioni non sono fisiologiche rilevanti e sono difficili da applicare per lo studio degli effetti di binding proteine7.

Il rapido sviluppo delle tecnologie di manipolazione di singola molecola ha permesso studi di chiusura e apertura di una biomolecola, ad esempio un DNA o una proteina, a livello di singola molecola con risoluzione nanometrica in tempo reale8. Microscopia a forza atomica (AFM), pinzette ottiche e magnetiche pinzette sono i più comunemente usati metodi di manipolazione di singola molecola. Rispetto a AFM e pinzette ottiche9, magnetiche pinzette permettono misurazioni stabili di chiusura-apertura dinamica di una singola molecola nei giorni utilizzando una tecnica anti-drift10,11.

Qui, una piattaforma di singola molecola manipolazione usando pinzetta magnetica per studiare la regolazione della stabilità di G4 da proteine leganti è segnalato12,13. Questo lavoro delinea gli approcci di base, tra cui campione e flusso preparazione di canale, il programma di installazione di pinzette magnetiche e la calibrazione di forza. Il controllo di forza e i protocolli di antislittamento come descritto nel passaggio 3 consentono misure di tempo lungo sotto diversi controlli di forza, ad esempio costante forza (forza di bloccaggio) e carico costanti votare (forza-rampa) e forza-salto misura. Il protocollo di calibrazione forza descritto nel passaggio 4 consente forza calibrazione di < 1 µm cavezze breve sopra una vasta forza gamma pN fino a 100, con un errore relativo all’interno di 10%. Un esempio di regolazione della stabilità del RNA Helicase associato AU-rich element (RHAU) elicasi (alias DHX36, G4R1) che gioca un ruolo essenziale nella risoluzione di che RNA G4 viene utilizzato per illustrare le applicazioni di questa piattaforma13.

Protocol

Ho > esempio di impostazione e identificare singole dsDNA tether formazione Tether delicatamente il flusso in 200 X diluito M-280, paramagnetici perle nella soluzione di saggio (100 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 10 mM Tris-pH 7,4 ) in un canale. Incubare per 10 minuti consentire le perline da associare alla biotina di molecole di DNA immobilizzati sulla superficie rivestita con SMCC fino alla fine del tiolo-etichettati. Delicatamente lavare via un-tethered perline utilizzando 200…

Representative Results

qui per visualizzare la versione ingrandita di questa figura. Figura 5: Misurazioni di forza-salto del G4 svolgimento.(A) traccia di tempo rappresentativo del cambiamento di altezza tallone durante forza saltare cicli tra 1 pN e pN 54 misurata senza DmRHAU, con 10 nM DmRHAU ma senza ATP e con 10 nM DmRHAU e 1 mM ATP, come indicato nel pannello di figura. (B…

Discussion

Come descritto sopra, una piattaforma per lo studio della stabilità meccanica del G4 DNA e le interazioni della proteina a G4 utilizzando una pinzetta magnetica di singola molecola è segnalata. Accompagnando la piattaforma, sono sviluppati protocolli altamente efficienti di trovare G4 DNA tether e misura della chiusura-apertura dinamica e la stabilità della struttura G4 con risoluzione speciale nanometri. Il bloccaggio del piano focale consente controllo antislittamento altamente stabile, che è importante per la rile…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano Meng Pan per la correzione del manoscritto. Questo lavoro è supportato da Singapore Ministero di formazione accademica ricerca fondo Tier 3 (MOE2012-T3-1-001) per J.Y.; la Fondazione di ricerca nazionali attraverso l’Istituto Mechanobiology da Singapore a J.Y.; il National Research Foundation, ufficio, Singapore del primo ministro, nell’ambito del programma Investigatorship NRF (NRF Investigatorship premio No. NRF-NRFI2016-03 al J.Y.; il fondo di ricerca fondamentale per le Università centrale (2017KFYXJJ153) di H. Y.

Materials

DNA PCR primers IDT DNA preparations
DNA PCR chemicals NEB DNA preparations
restriction enzyme BstXI NEB R0113S DNA preparations
coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm) BMH.BIOMEDIA 72204 flow channel preparation
Decon90 Decon Laboratories Limited flow channel preparation
APTES Sigma 440140-500ML flow channel preparation
Sulfo-SMCC ThermoFisher Scientific 22322 flow channel preparation
M-280, paramganetic beads,streptavidin ThermoFisher Scientific 11205D flow channel preparation
Polybead Amino Microspheres 3.00 μm Polysciences, Inc 17145-5 flow channel preparation
2-Mercaptoethanol Sigma M6250-250ML flow channel preparation
Olympus Microscopes IX71 Olympus IX71 Magnetic tweezers setup
Piezo-Z Stages P-721 Physik Instrumente P-721 Magnetic tweezers setup
Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X Olympus MPLAPON-Oil 100X Magnetic tweezers setup
CCD/CMOS camera AVT Pike F-032B Magnetic tweezers setup
Translation linear stage Physik Instrumente MoCo DC Magnetic tweezers setup
LED Thorlabs MCWHL Magnetic tweezers setup
Cubic Magnets Supermagnete Magnetic tweezers setup
Labview National Instruments Magnetic tweezers setup
OriginPro/Matlab OriginLab/MathWorks Data analysis
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References

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G-quadruplexMagnetic TweezersSingle-molecule ManipulationFolding And UnfoldingBinding ProteinsDNA-protein InteractionsHelicase ActivityDNA Tether FormationParamagnetic BeadsNanometer-scale Dynamics

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You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers. J. Vis. Exp. (127), e56328, doi:10.3791/56328 (2017).
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