JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
癌症研究

МикроРНК основе жидкого биопсия: Опыт плазмы Мирна подпись классификатора (MSC) для скрининга рака легких

Published: October 26, 2017
doi:
10.3791/56326
, , , , , , , ,
1Department of Experimental Oncology and Molecular Medicine,Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori, 2Unit of Thoracic Surgery,Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori

Summary

Здесь мы представляем подробный протокол, принятый в BioMILD скрининг суда для выполнения циркулирующего микроРНК подпись классификатор тест для раннего обнаружения рака легких.

Abstract

Развитие малоинвазивных теста, например жидких биопсии, для раннего обнаружения рака легких на доклинической стадии важно улучшить исход этой смертельной болезни. МикроРНК (интерферирующим) являются ткани конкретные, маленькие, некодирующих РНК, регулировании экспрессии генов, которые могут выступать в качестве посыльных внеклеточных сигналов биологических производный от перекрестных помех между опухолью и его окружающие микроокружения. Они могут таким образом представляют собой идеальные кандидаты для раннего выявления рака легких. В этой работе предлагается методологических рабочего процесса для проверки потенциальных циркулирующего Мирна теста с помощью пользовательских сделал microfluidic карты и количественного PCR реального времени в образцах плазмы добровольцев, поступил в легких рака, скрининг суда. Кроме того поскольку освобождение связанных с гемолизом адаптивной и более общие технические вопросы могут повлиять на анализ, также представлены меры контроля качества, включены в стандартные оперативные процедуры. Протокол воспроизводимость и дает надежные количественные результаты; Однако при использовании больших клинических серии, предварительно аналитическую и аналитические функции следует осторожно оценивать.

Introduction

Рак легких является наиболее часто диагноз рака во всем мире, приходится около 25% всех диагнозов рака1. Несмотря на неуклонное сокращение легких рака смертности за последние 2 десятилетия, главным образом вследствие сокращения табакокурения рака легкого остается ведущей причиной смерти от рака у мужчин и женщин. В 2017 году по прогнозам приходится приблизительно 25% и 20% всего случаев смерти от рака в Соединенных Штатах и Европе, соответственно,1,2.

Так как симптомы не возникают обычно в начале заболевания, большинство рака легких диагностируется на поздних стадиях. Это приводит к возможности ограничены для терапевтического вмешательства и плохой эффективности лечения3. Таким образом многие научные усилия направлены на определение эффективного тест для раннего обнаружения рака легких.

Разнообразие скрининговых исследований показывает, что рентгенография не имеет значения в легких скрининге рака, тогда как низкие дозы компьютерная томография (LDCT)-это средство лучше, по сравнению с рентгенография для обнаружения рака легких ранней стадии4. Кроме того было показано, что thatscreening с использованием LDCT сократить смертность от рака легких среди нынешние и бывшие курильщики5до 20%. Эти данные подтверждают использование скрининга рака легкого в популяции высокого риска, определенных в руководящих принципах по несколько профессиональных обществ4,6.

Следует отметить, что среди основных проблем о LDCT скрининг является высокий уровень ложно положительных результатов и чрезмерной диагноз. Что таким образом, научное сообщество ищет стратегию для преодоления этих проблем и увеличения специфичности LDCT скрининг-теста. Разработка неинвазивных взаимодополняющих биомаркеров может быть полезным здесь. На сегодняшний день, существует обширный список кандидата биомаркеров под следствием, например адаптивной, свободных клеток ДНК, Джин метилирования, маленькие белки и другие7.

На основе крови биомаркеров, включая Биомаркеры иммунный ответ и циркулирующих адаптивной, являются те, которые достигают более продвинутые стадии проверки8. Иммунный ответ биомаркеров основаны на знании, что иммунный ответ против обоих внутриклеточные и поверхности опухолевых антигенов встроены в больных раком легких9. К примеру, Ajona и др. оценку роли C4d, продуктом разложения классической дополнением путь в диагностике и прогнозе рака легких10. В противном случае коммерчески доступных аутоантител сыворотки тест, изучение семь связанных с опухолевых антигенов проверяются в немелкоклеточного больных раком легкого и показал 36% чувствительность и специфичность1191%. Иммунный ответ биомаркеров интересны, но необходимы дальнейшие исследования проверки для потенциальных клинического применения.

интерферирующим являются эндогенные малые некодирующих РНК с сохраняется механизм и большой функциональную значимость всего животного и растительного царства. Роль адаптивной заключается в регулировании белка перевод: они подавляют выражение большого набора целевых генов12. Он хорошо задокументировано что выражение ofmiRNAs изменения внести вклад в патогенезе большинства человеческих рака12,,1314. Кроме того опухоль и стромальные клетки релиз адаптивной, стабилизируемых путем их включения в микровезикулы или через ассоциацию для RNA-связывая протеинов, в жидкостях организма, например, сыворотки и плазмы15,16, моча17 и слюна18. Циркулирующих интерферирующим может таким образом отражать принимающей ответ и динамического взаимодействия между опухоли и ее микроокружения19. Вместе взятые эти замечания сделали циркулирующего интерферирующим перспективных класса биомаркеров для обнаружения рака человека.

Циркулирующих интерферирующим могут быть обнаружены с помощью различных методов: microarray платформ20, количественные обратной транскрипции ПЦР (RT-ПЦР)21и следующего поколения последовательности (НГС)14,22. В последние годы были разработаны различные исследования профиль выражение, на основе вышеупомянутых технологий. Microarray — это технология высокой пропускной способности, возможность анализировать до тысячи интерферирующим в один единый assay. Однако он имеет меньше динамический диапазон и специфичностью, по сравнению с RT-ПЦР или NGS. Кроме того microarray является не количественный метод, поэтому далее экспериментальная проверка не требуется. Методы на основе последовательности можно разрешить идентификации неизвестных адаптивной и подходят особенно в фазу обнаружения. С другой стороны NGS методы все еще дорого и требует специального оборудования и экспертов биоинформатики, тем самым ограничивая их использования в больших проверки когорты и в клинических условиях23. На данный момент RT-ПЦР является наиболее принимается платформой для циркулирующих Мирна обнаружения в диагностический/клинические контексте24. Существуют различные технологии RT-ПЦР для адаптивной анализа, но стебель петля RT, следуют TaqMan PCR является наиболее широко используемым25. Этот метод является чрезвычайно чувствительным и точным (одного нуклеотида дискриминации) и имеет высокий динамический диапазон; Однако это позволяет обнаружение известных интерферирующим только.

Контроль качества микроРНК исследование (miRQC исследование), Местдагом, et al. широко исследованы характеристики некоторых коммерчески доступных платформ для адаптивной профилирование, основанное на трех вышеупомянутых технологий26. Анализируя 196 интерферирующим в образцах сыворотки крови и тканей, производительность различных платформ был оценивать с точки зрения воспроизводимости, чувствительность, точность, специфика и согласование дифференциальных выражения. Результаты показали, что платформ на основе NGS и технологии microarray дна имели более высокую воспроизводимость и специфичности, но RT-ПЦР платформ были более точные, чувствительной и имели более высокий уровень обнаружения, особенно для низкого входного РНК образцов, таких как тело жидкости. Таким образом RT-ПЦР, как представляется, наиболее подходящим методом для возможного применения в повседневной клинической диагностики.

В 2011 году Sozzi et al. проанализировали Мирна профиля плазмы, пробах добровольцев, зачисленных в первый LDCT screeningtrial (INT-НОО суда)27 и четыре подписи Мирна, составленный взаимные отношения среди 24 циркулирующих адаптивной были созданы. Эти подписи были способен различать заболевания освободить людей от пациентов с любым или смертоносного рака легких на время или до 2 лет до обнаружения болезни LDCT28. В еще один документ, той же группы, описанные в первый раз Мирна подпись классификатора (MSC), полученные путем объединения четырех Мирна подписей для того, чтобы стратифицировать пациентов в трех уровнях риска: высокого, среднего и низкого. Его клинической полезности был апробирован в большой ретроспективной набор более чем 1000 лиц, обучающихся в процессе мягкая скрининга, рандомизированное исследование, сравнивающее ежегодных или двухгодичных LDCT оружия с рукой наблюдения29. Действительно сочетание MSC и LDCT снизил ставку ложно положительных LDCT, около 5 раз и были три группы риска MSCсвязанные с общей выживаемости.

Позже, в 2013 году в «Фондом IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori» (Милан, она) перспективных скрининг суда (BioMILD) реализации LDCT с плазмой, на основе MSC тест был запущен. Добровольцы, поступил в BioMILD суда проходят LDCT и крови вывода, который обрабатывается немедленно для разделения плазмы для Мирна, профилирование с помощью пользовательских сделал microfluidic карт. Сочетание LDCT и MSC результатов определяет конкретные скрининг алгоритм24.

В настоящей работе описан весь методологических протокол, используемый в процессе BioMILD, начиная от сбора образцов крови, плазмы изоляции, извлечение RNA, и выражение 24 адаптивной, профилирование с помощью пользовательских сделал RT-ПЦР microfluidic карт. Учитывая высокую согласованность и воспроизводимость, эти процедуры могут также использоваться для разработки на основе Мирна жидкого биопсии при других заболеваниях.

Protocol

протокол был одобрен Комитет по этике исследований нашего института. 1. проб плазмы собирать 10 мл цельной крови образец Vacutainer пробирки с ЭДТА 2 K спрей покрытием и хранить при комнатной температуре. Примечание: Для сведения к минимуму гемолиза, отдельные плазмы в течение 2 ч. Не храните цельной крови при низкой температуре (т.е., 4 ° C) во избежание теплового шока и мобильных лизиса, которые приводят к неспецифическим Мирна выпуска. В течение 1 ч, отделить плазмы первый шаг центрифугирования в 1258 x g и 4 ° C на 10 мин. Передачи супернатанта плазмы в 15 мл трубку, тщательно избегая контакта с лимфоцитарный кольцо. Центрифуга плазмы во второй раз в 1258 x g и 4 ° C на 10 мин. Аликвота 1 мл плазмы в 1,5 мл криопробирки, избегая сбор фракция плазмы на базе трубки. Хранить все аликвоты на − 80 ° C, за исключением одного, для оценки гемолиза. Молекулярный анализ должны быть выполнены в течение 5 недель. 2. Оценка гемолиза спектрофотометрические измерения сразу же после разделения шаг плазмы, в кювет для спектрофотометрия, сделать 1:10 разбавления образца плазмы в ПБС (например, 100 мкл плазмы в 900 мкл 1 X PBS) и смеси для гомогенизации it. Примечание: Образец плазмы не должны быть заморожены, прежде чем спектрофотометрические измерения, как замораживание оттаивание образца (и, в частности в lipemic образцах), могли бы стать, Флоккулянты которые мешают спектрофотометрический анализ. Читать поглощения на 375 Нм, 414 Нм, 541 Нм и 576 Нм, используя Спектрофотометр UV-Vis, коррекция базовой линии поселились на 750 нм и длиной пути 10 мм. выполнить пустой измерения с использованием 1 мл ПБС. Расчет соотношения между поглощения в 414 Нм и 375 Нм; если выше 1.4, рассмотрим пример Опаковые и повторить снятие крови (QC1 в таблице 1). 3. Общая добыча РНК плазмы подготовить раствор 1-Thioglycerol/гомогенизации (OMG) с 20 мкл 1-Thioglycerol мл раствора гомогенизации. Поскольку 1-Thioglycerol вязкой, тщательно Пипетка для точного измерения. Холод OMG решение на льду или в 2-10 ° C перед использованием it. Примечание: Рабочий раствор стабилен при температуре 2-10 ° C на 1 месяц. Приостановить лиофилизированные DNase я, добавив 275 мкл свободной от нуклеиназы воды в пробирку и осторожно перемешать (делать не вихрь). Как наглядное пособие, добавить 5 мкл синего красителя для воссоздания DNase I и распределять решение в одноразовых аликвоты в свободной от нуклеиназы трубы. Сохранять восстановленный DNase I на-30 ° C до -10 ° с. Начиная с 200 мкл плазмы, 200 мкл раствора охлажденные OMG. Водоворот 15-30 s для обеспечения полной гомогенизации. Если происходит вспенивание, пусть образец поселиться на льду Добавить 200 мкл буфера Lysis и 25 мкл протеиназы K гомогенизированных образцов и вихревые для 20 s. Инкубировать образцы для 15 мин в thermomixer разогретую на 37 ° C. Загрузка картриджа для каждого образца на палубе лоток документа и место штопфер в надлежащее положение. Передачи lysate соответствующей позиции инструмента картриджа в. Добавить 5 мкл DNase I решения в надлежащее положение картриджа в. Добавить 60 мкл нуклеиназы свободной воды на базе каждой трубы элюции. Выберите " RSC Мирна ткани " метод и начать автоматизированной очистки запуска. Общая образцов РНК может храниться в − 80 ° C. 4. На основе Taq RT использовать пул грунтовка RT Taq с адаптивной интерес для преобразования РНК в cDNA с Taq микроРНК вспять транскрипции Кит. Подготовить 12 мкл RT реакция смеси на льду в 1,5 мл трубки microcentrifuge согласно инструкциям, комплект, используя 6 мкл пользовательские бассейн грунтовка RT Taq. Добавить 3 мкл всего РНК окончательный объем 15 мкл и инкубировать во льду на 5 мин Загрузить реакции RT на термо велосипедист настроена следующим образом: 16 ° C в течение 30 мин, 42 ° C в течение 30 мин, 85 ° C за 5 мин и провести на 4 ° C. Примечание: CDNA можно хранить при от -15 до-20 ° C для по крайней мере одной недели. 5. Предварительное усиление Mix 2,5 мкл каждого продукта RT с 12,5 мкл Taq Мастер микс 2 x, 3,75 мкл Custom Taq бассейн и 6,25 мкл нуклеиназы свободной воды, суммарный объем 25 мкл. Выполнять предварительное усиление реакции с помощью термо велосипедист согласно следующей тепловой профиля: 95 ° C в течение 10 мин, 55 ° C на 2 мин., 72 ° C на 2 мин, 12 циклов 95 ° c 15 s и 60 ° C в течение 4 мин , затем, удерживая на 99,9 ° C в течение 10 минут и 4 ° C. Разбавить продукт, добавив 175 мкл 0.1 X TE, рН 8.0. Примечание: Разбавленного продукта может быть магазина в от -15 до-20 ° C для по крайней мере одной недели. 6. Реакции RT-ПЦР на пользовательских Taq массив микроРНК карты использования 384-ну microfluidicCustom Taq массив микроРНК карты для измерения плазменных уровней 24 конкретных интерферирующим (пятнистый в двух экземплярах) на 8 образцов одновременно. MiRBase ID (v21) для 24 интерферирующим являются: имеет мир-101-3 p, имеет мир 106А – 5p, имеет мир-126-3 p, p имеет мир 133а – 3p, имеет мир-140-3, имеет мир-140-5 p, имеет мир-142-3 p, имеет мир-145-5 p, имеет мир 148Б – 3p, имеет мир 15b – 5p, имеет мир-16-5 p, имеет мир-17-5 p, имеет мир-197-3 p, имеет мир 19б – 3p, имеет мир-21-5 p, имеет мир-221-3 p, имеет мир-28-3 p, имеет мир 30б – 5p, имеет мир – 30c – 5p, имеет мир 320a, имеет мир 451а, имеет мир-486-5 p, имеет мир-660-5 p и имеет мир 92a – 3p. Смесь 1.13 мкл разбавленного образца предусилитель с 56,25 мкл 2 X Taq универсальный Мастер микс и 55.69 мкл нуклеиназы свободной воды в 0,5 мл. Загрузки до 8 микс реакции ПЦР на пользовательских Taq массив микроРНК карты. Центрифуга на 311 x g на 2 мин Уплотнение пользовательские карты с массива карты sealer. Запуска в реальном времени реакции, с помощью системы PCR реального времени изменения Велоспорт параметров, как следует: 94.5 ° C в течение 10 мин, 40 циклов 97 ° c за 30 s и 59.7 ° C 60 s. 7. Экстраполяция данных и коэффициентов поколения использования программного обеспечения для получения необработанных значений Ct, установив Автоматическое вычитание базовой линии для удаления фона сигналов и фиксированный порог 0,15 для всех проб и образцов. Удалить пятна с бедных амплификации кривых и/или плохой пассивного ведения сигналов. Экспорт необработанных значений Ct в " .xls " формат и использовать Ct означает значение двух дубликатов для дальнейшего анализа. Коррелят интерферирующим ' уровни выражения для исторического измерения на образцах клинического исследования (Таблица 2). Если по крайней мере 50% проб на каждой карточке пользовательские сделал microfluidic Пирсон ' s корреляции < 97,5, повторите карты (QC2 в таблице 1). Расчет − ΔCts между всеми адаптивной, эквивалентно log2 значения коэффициентов Мирна. 8. Оценка гемолиза похожие микроРНК подпись создать связанные с гемолизом Мирна подпись, используя следующие коэффициенты Мирна с соответствующими обрезков (log2 значения) для коротких хранения проб плазмы (1-5 недель в − 80 ° C): Мир-126/451 < − 0,07, 15В/451 < − 3.67, 221/451 < − 3.18, 30б/451 < − 1.1, 126/486-5p < − 0,33, 15В/486-5 p < − 3.86, 221/486-5 p < − 3.17, 30б/486-5 p < − 1.42, 126/92a < 1.8, 15В/92a < − 1.8, 221/92a < − 1.04, 30б/92a < 0,87, 126/16 < − 2.85, 15В/16 < − 6.33, 221/16 < − 5.9, 30б/16 < − 3.68. Классифицируются как опаковые образцы, где по крайней мере 50% соотношения (8 из 16) превышают соответствующие отсечения (QC3 в таблице 1). 9. Определение уровня риска: высокий, средний и низкий определить четыре подписи соотношений Мирна, составляющих MSC, как на рисунке 3: риск заболеваний (РР), риск заболевания (RAD), агрессивное присутствие болезнь (PD) и наличие агрессивной болезни (PAD). Для каждой подписи, определить соотношение превышает соответствующие порогового значения для коротких хранения проб плазмы (1-5 недель в − 80 ° C). Это число превышает показатели необходимо учитывать позитивные 9 из 27 RD и PD и 14 из 28 RAD и PAD ( рис A). Атрибут для каждого образца соответствующего уровня риска MSC следующим: низкий риск, если RD neg ∩ PD neg ∩ RAD neg ∩ PAD neg; промежуточных риск если RD pos ∪ PD pos ∩ RAD NEG ∩ PAD neg; или высокий риск если RAD pos ∪ PAD pos ( рис. 3 B).

Representative Results

BioMILD суд-проспективное исследование для раннего обнаружения рака легких с целью тестирования эффективности комбинированного подхода LDCT-MSC в качестве первой линии скрининговых тестов в большой когорты лиц, заядлый курильщик. Класс риска приписывается каждого из добровольцев на основе Мирна тест, который оценивает соотношения между 24 интерферирующим циркулирующей плазмы. Как основном сообщил30,,3132гемолиз является одним из важнейших вопросов для анализа оборотных Мирна, так как ложные результаты могут быть получены за счет неспецифического релиз интерферирующим клеток крови. В рабочем процессе предлагаемой методологии, предварительно аналитического контроля качества шаг (QC1 в таблице 1) для выявления Опаковые, и таким образом не анализируемые, образцы плазмы был описан. Рисунок 1 сообщает спектрофотометрический анализ Опаковые (рис. 1А) и не опаковые образцы плазмы (рис. 1Б) с соответствующими значениями A414/A375. В клинических условиях были результатом молекулярной теста имеет решающее значение для управления добровольцами, этот QC1 позволяет повторять проб крови и, в большинстве случаев восстановление образца. После молекулярной обработки, RT-ПЦР производительности должно оцениваться точно определить любые технические вопросы. Рисунок 2 A показывает RT-ПЦР с низкой производительности из-за плохой пассивной опорного сигнала. В этом случае перезагрузка предварительного усиления продукта на новую карту microfluidic рекомендуется. Когда RT-ПЦР выполняет хорошо, как показано на рисунке 2B, карта переходит к первому шагу пост аналитического контроля качества для обеспечения сопоставимости с историческое измерение значения выражений Мирна (QC2 в таблице 1). Если QC2 шаг завершился с ошибкой, техническая проблема, произошедших во время обратной транскрипции или предварительное усиление реакции, и это удобно повторить весь молекулярной обработки, начиная с обратной транскрипции. Последний этап контроля качества (QC3 в таблице 1) оценивает гемолиз также на молекулярном уровне. Уровни выражения 4 эритроцитов конкретных интерферирующим (мир-16, мир-451, мир-486-5 p и мир 92a) были по сравнению к тому из 4 связанных интерферирующим не гемолиз (мир-126, мир 15b, мир-221 и мир 30б), генерации подписи связанных с гемолизом Мирна составленный 16 (4 x 4) коэффициенты Мирна. Положительные образцы классифицируются как Опаковые, в то время как негативные примеры приступить к окончательной классификации уровня риска MSC, как описано в раздел 9 протокол и на рисунке 3. Рисунок 1: Спектрофотометрический анализ образцов свежей плазмы. Спектрофотометрические профили (A) 2 Опаковые и (B) 2 плазмы не опаковые образцы, измерения оптической плотности соотношение волн A414 и A375. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2 : RT-ПЦР производительности в microfluidic карт анализа. Усилители и многокомпонентные участков бедных сравнения (A) и (B) хорошего качества microfluidic карты. Все 24 адаптивной и одного примера Мирна сообщается в каждой панели. Многокомпонентных участки иллюстрируют сигналы пассивного ссылки, происходящих в этих реакциях RT-ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3: MSC алгоритм для стратификации риска. Представитель результаты с учетом 6 образцы плазмы из добровольцев поступил в BioMILD скрининг судебного разбирательства. (A) подписи Мирна коэффициенты риска заболеваний (РР), риск заболевания агрессивных (RAD), наличие болезни (PD), присутствие агрессивных болезни (PAD) и соответствующих пороговых значений (log2) для образцов плазмы, температуре-80 ° C для наименее 1 неделю и до 5 недель. (B) сочетание четырех подписей для стратификации Анализируемые образцы в высоком (H), средний (I) и низкого MSC (L) уровень риска. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Ловушки и трудности методологического рабочего процесса
Как BioMILD это первое проспективное исследование, анализ циркулирующих интерферирующим как диагностический инструмент, порогов и обрезков, используются для анализа данных были получены из ретроспективных рядов. Для того, чтобы преодолеть проблему интервала хранения проб плазмы, параметры могут быть изысканный возможно получить повышение производительности MSC. Тем не менее перед началом анализа адаптивной, несколько аспектов общего процесса необходимо тщательно оценить, как критерии включения, сбора и обработки, и алгоритм биоинформатики приняла для анализа данных. Следующие разделы будет сосредоточиться на наиболее критических точек рабочего процесса, описанного в настоящем документе, решения основных вопросов каждый один шаг и затем предложить стратегии по их преодолению.

Обучение населения
Критерии регистрации для BioMILD скрининг судебного разбирательства являются: 50-75 лет старых, тяжелые нынешних или бывших (менее 10 лет) курильщиков с по крайней мере 30 пакет лет и без предварительного истории рака в течение 5 лет. В этой группе населения предполагаемое легких Рак распространенность и заболеваемость в год были соответственно около 1% и 0,7%. Чтобы применить MSC тестирования, как описано в предлагаемом протоколе, проанализированы населения следует поддерживать аналогичные характеристики. В частности QC2 шаг, описанные выше включает сравнение с заданной исторические данные, полученные из аналогичных населения. В то время как соотношение ниже 97,5 может свидетельствовать о технических проблем, с другой стороны, большинство людей с измененных циркулирующего Мирна уровнях, отражающих риск рака легких на самом деле ниже этого порога. Другими словами Если шаг QC2 с параметрами, сообщили здесь применяется к населению более высокому риску развития рака легких, он может исключить приемлемым образцы. Новые, надлежащего ссылочные параметры затем должны быть определены характерные для каждого населения анализируется согласно ожидаемые результаты.

Сбор крови и гемолиз
Сбор биологических образцов является важным шагом предварительной аналитической, так как это может повредить образец качества и характеристики и таким образом изменить окончательные результаты анализов. Что касается образцов крови важно для сбора свежей крови и как можно быстрее обработать образца. Образцы не хранить при 4 ° C не заморожены после вывода крови, поскольку замораживания и оттаивания проходы могут вызвать лизис клеток (гемолиз) и РНК деградации. Чтобы свести к минимуму процесс гемолиза, предлагается отделить плазмы в течение 2 ч от крови коллекции31 .

Гемолиз в основном обусловлено разбивка красных кровяных телец (эритроцитов) и последующего выпуска их содержания в окружающей среде. Это может быть проблемой для циркулирующих адаптивной, тестирование, потому что релиз RBCs внутриклеточное содержание резко изменяет профиль микроРНК в крови, потенциально влияющие на точность анализа на основе плазмы30.

Будучи в состоянии определить также минимальные уровни гемолиза в образцах плазмы имеет решающее значение для исследований, основанных на циркулирующих интерферирующим качестве биомаркеров. Гемолиз первоначально могут оцениваться путем визуального осмотра, поскольку после двух центрифугирования шаги, которые цвет плазмы может варьироваться от желтого до красного для высоко опаковые образцы. Однако простой визуальный осмотр не может быть достаточно чувствительным, в контексте биомолекулярного исследований.

Простой, предварительно аналитический метод идентификации образцов Опаковые плазмы является спектрофотометрические измерения на длине волны (λ) = 414 Нм основных оксигемоглобина пик поглощения, после соответствующей регулировки для любой другой источник помех. По этой причине мы нормированный 414 Нм пик поглощения значение на 375 Нм, свидетельствует о липидный контента33. Кроме того, или лучше, в сочетании, липемии independenthemolysis Оценка (HS) может быть используется34. Эта процедура спектрофотометрически основе можно определить по крайней мере 6,1 мг/дл свободного гемоглобина. В противном случае опаковые образцы могут быть определены путем выявления эритроцитов конкретных адаптивной. Так как даже очень низкий процент гемолиза может вызвать значительное увеличение эритроцитов конкретных Мирна уровни32, Фортунато et al. определили конкретные связанные с гемолизом подписи, основанные на 16 интерферирующим коэффициенты, которые могут эффективно Классифицируйте гемолиз в плазме образцы33. Все упомянутые анализов могут быть использованы в комбинации с коэффициент поглощения 414/375 и/или СС принимаются в предварительной аналитической фазы, сохранения дополнительных расходов, тогда как измерения связанных с гемолизом интерферирующим могут быть использованы в постсоветском аналитический этап как контроль качества шаг.

Циркулирующих интерферирующим изоляции и РНК чистоты
Извлечение RNA процедура является весьма влиятельных шаг успех последующих анализов. Начиная с низкой образца ввода, таких как плазма, добыча должна быть максимально эффективной для обеспечения точной количественной адаптивной. Плазмы характеризуется высокой концентрации многих белков, включая nucleases и другие компоненты, которые могут мешать течению ферментативные реакции RT-ПЦР и может повлиять на циркулирующих интерферирующим обнаружения. В этих типах исследований были использованы несколько методов извлечения, но в целом, органические извлечения следуют на основе силики РНК обогащения позволяет удаления плазмы ингибиторы лучше, то Тризол только35. Тем не менее в последние несколько лет, ручная добыча была заменена автоматического извлечения. Незначительные риск загрязнения, более высокой воспроизводимостью и экономических время использования являются основные преимущества автоматизированных систем, по сравнению с ручной изоляции протоколов. Кроме того методы автоматического извлечения принесли наибольшие объемы Мирна из образцов крови и самую высокую эффективность по сравнению с ручной протоколы36.

Вопрос нормализации
Нормализация уровня в плазме Мирна по-прежнему является спорным вопросом. Действительно различия в образец качества или количества могут мешать идентификации истинной изменения в уровнях выражения адаптивной, вызванные присутствием или риска заболеваний и таким образом приводит к интерпретации неоднозначных данных и выводов в заблуждение. До настоящего времени отсутствие консенсуса привело к различных нормализации стратегии37.

Общая РНК, извлеченные из образцов плазмы обычно ниже порога стандартных количественной оценки методов, таких как УФ-спектрофотометрии или на основе флуоресценции спектрофотометрия, исключая таким образом РНК массового стандартизации38. Следовательно фиксированным объемом, а не фиксированное количество eluted РНК должен быть выбран в качестве входных данных для реакции RT39.

Уборка номера протоколов, используемых для анализа микроРНК в образцах тканей, как RNU48 и RNU6, не подходят для нормализации внеклеточного Мирна измерений, как оба они обнаруживаются не всегда в обращении, из-за деградации РНКазы опосредованной40, и также дерегулирование в форме конкретных заболеваний37. Неясно, если любой циркулирующего интерферирующим может эффективно использоваться как ссылающиеся на элементы управления. Например для уборки, но d часто предлагается мир-16етры исследования показали, что он является дерегулирование в образцах плазмы раковых больных28,37. Кроме того мир-16 уровней, весьма подвержены гемолиз30.

Хотя для анализов высок объём измерения несколько адаптивной и нормализующее на значении означает выражение общепринятых41, когда ограниченное количество интерферирующим необходимо проанализировать, не может применяться этот подход нормализации. Чтобы обойти проблему нормализации, Boeri et al. ранее создан алгоритм, основанный на взаимных соотношений между 24 интерферирующим28. Такой подход, несмотря на то что очень полезно для развития диагностического инструмента, не позволяют легко отличительный эффективно изменены адаптивной, возможно имеющих роль в развития опухоли и таким образом определить интерферирующим как функционирования калибраторы. Еще одна эффективная стратегия, принятый Группой Бьянки et al. , разработан сыворотки мир тест для раннего обнаружения рака легких, была основана на нормализацию на геометрическое группы 6 «уборка сыворотки адаптивной» различной меньше среди образцов и классы из42больных.

Особенности на основе Мирна жидкого биопсии и возможности применения
На основе плазмы MSC является молекулярный неинвазивный тест изучал для ранней диагностики рака легких в курильщики. MSC тестов можно определить промежуточные или высокого риска темы до обнаружения рака легких, LDCT, с высокой чувствительностью (SE, 87%) и предсказательная ценность отрицательного результата (NPV, 99%). В частности MSC может реализовать LDCT скрининг путем уменьшения ложно положительных результатов до 3,7%, от 19,7% для LDCT только29. MSC тест показал также иметь хорошую прогностическую производительность при рассмотрении только легких у больных раком и может использоваться в качестве инструмента мониторинга отдельно или в сочетании с другими клинической патологической параметры43,44. Потенциально MSC тестов может позволить большей согласованности легких Рак диагностических алгоритмов, что приводит к снижению эффективности скрининга.

Кроме того, КБМ поступили другие неинвазивные тесты для раннего обнаружения рака легких. Бьянки и др. предложил циркулирующего мир тест на основании подписи 34-miRNA45, а затем сократил его до подписания 13 Мирна42. Fordiscovery образцов сыворотки и проверки были получены от непрерывного наблюдения на некурящих предметов (космос) LDCT скрининг судебного разбирательства, выступали на Европейский институт онкологии (НОО, Милан, Италия). Мир тест показал 78% точности для обнаружения рака легких в риска добровольцев. Между 13 сыворотки адаптивной и 24, составляющих MSC только 5 интерферирующим перекрывающимися (мир 92А, мир 30Б, мир – 30c, 148а мир и мир-140-5 p). Это может быть связано для различных типов начиная образцы (Сыворотка против плазмы) и разработке данных. В самом деле мир-теста, авторы выбранных интерферирующим 6 себя как уборка в сыворотке, 3 из которых были включены также среди MSC Мирна соотношения (мир 15b, мир 19b и мир-197). Тем не менее MSC в плазме и мир тест в образцах сыворотки более глубоко проверить использование на основе Мирна жидкого биопсии для выявления рака легких.

Интерферирующим профилирование для идентификации биомаркеров рака легких также над образцов мокроты46. Мокрота может быть легко собрана и уровни выражения Мирна, как представляется, чрезвычайно стабильной в нем. Однако добровольцы скрининга рака легкого являются старше 50-55 лет и курильщики с сопутствующие заболевания, такие как ХОБЛ, таким образом делая мокроты трудно получить. Действительно, среди различных жидкостей тела, плазмы является одним из лучших альтернатив для изучения потенциальной роли интерферирующим как (но не ограничиваясь) биомаркеров рака легких.

В целом процедура, описанная в настоящем документе могут быть актуальными в контексте различных заболеваний, без ограничений, в типе патологии, расследование (от рака, нервной системы и сердечно-сосудистые расстройства, или диабет) и в цель Клиническое применение (биомаркер для диагностики, прогноза или даже ответ на лечение).

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарят Paola Suatoni, Елена пульсоксиметры, Каролина Ninni, Annamaria Calanca, и Кьяра Банфи для обработки добровольцев в испытаниях и административной помощи; и Клаудио Jacomelli и Клаудио Citterio для управления данными. Работа была поддержана итальянской ассоциации по исследованию рака [следователь грантов № 15928 вверх, 14318 GS и 12162 (специальная программа «Инновационные инструменты для оценки риска рака и ранней диагностики», 5 x 1000)]; Итальянское Министерство здравоохранения [Грант № RF-2010]; Грант UO1 CA166905 Национальный институт рака (США). МБ была поддержана Fondazione Pezcoller стипендий.

Materials

 1x PBS  Lonza BE-17-516
20xTE Buffer, pH 8.0 Molecular probe T11493 Dilute the 20X stock solution to have the final concentration of  0,1X in Nuclease-free water
Nuclease-free water 
Maxwell RSC miRNA Tissue Kit  Promega AS1460 The kit contains Homogenization Solution, DNase I, Proteinase K, Lysis Buffer and cartridges. For 1-Thioglycerol, inhalation and contact with skin and eyes should be avoided. Use it under a Fume Cabinet.
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit  Thermo Fisher 4366596
Custom TaqMan RT Primer Pool  Thermo Fisher 4459649
TaqMan PreAmp Master Mix 2X  Thermo Fisher 4391128
Custom TaqMan  PreAmp pool  Thermo Fisher 4459657
TaqMan Universal Master Mix II, No UNG 2x  Thermo Fisher 4440048
Custom TaqMan Array MicroRNA Cards  Thermo Fisher 4449137 Bring the Custom TaqMan Array MicroRNA Cards to room temperature before to load samples
Vacutainer Safety-Lock Blood Collection Set  Becton Dickinson 367286-364815
Vacutainer plastic spray-coated K2EDTA tube.  Becton Dickinson 366643 Lavender BD Hemogard closure 
Cuvette PS semi-micro  VWR/PBI  643-0326 Light path 10 mm
NanoDrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer Thermo Fisher
Cryogenic vials 1.5 ml  Sigma-Aldrich Z359033
Centrifuge 5810R  Eppendorf Bring the centrifuge to 4 °C before starting plasma collection
Heraeus Multifuge 3S+ Centrifuge Thermo Fisher D-37520
Vortex Mixer Velp Scientifica F202A0173
ThermoMixer T- shaker Euroclone  A00564 Bring the Thermo Mixer to 37 °C before starting RNA  extraction
Maxwell RSC Instrument Promega AS4500
GeneAmp PCR System 9700 thermo-cycler  Thermo Fisher
ViiA 7 Real-Time PCR System  Thermo Fisher
ViiA 7 RUO software  Thermo Fisher
Arrey Card Staker/Sealer Thermo Fisher 4331770
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA Cancer J Clin. 67 (1), 7-30 (2017).
  2. Malvezzi, M., et al. European cancer mortality predictions for the year 2017, with focus on lung cancer. Ann Oncol. , 10 (2017).
  3. Miller, K. D., et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66 (4), 271-289 (2016).
  4. Kanne, J. P. Screening for lung cancer: what have we learned. AJR Am. J Roentgenol. 202 (3), 530-535 (2014).
  5. Aberle, D. R., et al. Reduced lung-cancer mortality with low-dose computed tomographic screening. N Engl J Med. 365 (5), 395-409 (2011).
  6. Wender, R., et al. American Cancer Society lung cancer screening guidelines. CA Cancer J Clin. 63 (2), 107-117 (2013).
  7. Molina-Vila, M. A., et al. Liquid Biopsy in Non-Small Cell Lung Cancer. Front Med (Lausanne). , 69 (2016).
  8. Sozzi, G., Boeri, M. Potential biomarkers for lung cancer screening. Transl Lung Cancer Res. 3 (3), 139-148 (2014).
  9. Shepherd, F. A., Douillard, J. Y., Blumenschein, G. R. Immunotherapy for non-small cell lung cancer: novel approaches to improve patient outcome. J Thorac Oncol. 6 (10), 1763-1773 (2011).
  10. Ajona, D., et al. Investigation of complement activation product c4d as a diagnostic and prognostic biomarker for lung cancer. J Natl Cancer Inst. 105 (18), 1385-1393 (2013).
  11. Boyle, P., et al. Clinical validation of an autoantibody test for lung cancer. Ann Oncol. 22 (2), 383-389 (2011).
  12. Hayes, J., Peruzzi, P. P., Lawler, S. MicroRNAs in cancer: biomarkers, functions and therapy. Trends Mol Med. , (2014).
  13. Croce, C. M. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer. Nat Rev Genet. 10 (10), 704-714 (2009).
  14. Iorio, M. V., Croce, C. M. MicroRNA dysregulation in cancer: diagnostics, monitoring and therapeutics. A comprehensive review. EMBO Mol Med. 4 (3), 143-159 (2012).
  15. Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nat Rev Clin Oncol. 11 (3), 145-156 (2014).
  16. Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (30), 10513-10518 (2008).
  17. Hanke, M., et al. A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker: microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancer. Urol Oncol. 28 (6), 655-661 (2010).
  18. Park, N. J., et al. Salivary microRNA: discovery, characterization, and clinical utility for oral cancer detection. Clin Cancer Res. 15 (17), 5473-5477 (2009).
  19. Boeri, M., Pastorino, U., Sozzi, G. Role of microRNAs in lung cancer: microRNA signatures in cancer prognosis. Cancer J. 18 (3), 268-274 (2012).
  20. Castoldi, M., et al. A sensitive array for microRNA expression profiling (miChip) based on locked nucleic acids (LNA). RNA. 12 (5), 913-920 (2006).
  21. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33 (20), 179 (2005).
  22. Schulte, J. H., et al. Deep sequencing reveals differential expression of microRNAs in favorable versus unfavorable neuroblastoma. Nucleic Acids Res. 38 (17), 5919-5928 (2010).
  23. Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers. Biomed Res Int. , 731479 (2015).
  24. Boeri, M., et al. Recent advances of microRNA-based molecular diagnostics to reduce false-positive lung cancer imaging. Expert Rev Mol Diagn. 15 (6), 801-813 (2015).
  25. Benes, V., Castoldi, M. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available. Methods. 50 (4), 244-249 (2010).
  26. Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
  27. Pastorino, U., et al. Early lung-cancer detection with spiral CT and positron emission tomography in heavy smokers: 2-year results. Lancet. 362 (9384), 593-597 (2003).
  28. Boeri, M., et al. MicroRNA signatures in tissues and plasma predict development and prognosis of computed tomography detected lung cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3713-3718 (2011).
  29. Sozzi, G., et al. Clinical Utility of a Plasma-Based miRNA Signature Classifier Within Computed Tomography Lung Cancer Screening: A Correlative MILD Trial Study. J Clin Oncol. 32 (8), 768-773 (2014).
  30. Pritchard, C. C., et al. Blood cell origin of circulating microRNAs: a cautionary note for cancer biomarker studies. Cancer Prev Res (Phila). 5 (3), 492-497 (2012).
  31. Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6 (9), 24145 (2011).
  32. Kirschner, M. B., et al. The Impact of Hemolysis on Cell-Free microRNA Biomarkers. Front Genet. 4 (94), (2013).
  33. Fortunato, O., et al. Assessment of circulating microRNAs in plasma of lung cancer patients. Molecules. 19 (3), 3038-3054 (2014).
  34. Appierto, V., et al. A lipemia-independent NanoDrop((R))-based score to identify hemolysis in plasma and serum samples. Bioanalysis. 6 (9), 1215-1226 (2014).
  35. Kim, D. J., et al. Plasma components affect accuracy of circulating cancer-related microRNA quantitation. J Mol Diagn. 14 (1), 71-80 (2012).
  36. Kulstein, G., Marienfeld, R., Miltner, E., Wiegand, P. Automation of DNA and miRNA co-extraction for miRNA-based identification of human body fluids and tissues. Electrophoresis. 37 (21), 2742-2750 (2016).
  37. Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification. Clin Chem. 61 (11), 1333-1342 (2015).
  38. Schlosser, K., McIntyre, L. A., White, R. J., Stewart, D. J. Customized Internal Reference Controls for Improved Assessment of Circulating MicroRNAs in Disease. PLoS ONE. 10 (5), 0127443 (2015).
  39. Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods. 50 (4), 298-301 (2010).
  40. Wang, K., et al. Comparing the MicroRNA spectrum between serum and plasma. PLoS One. 7 (7), 41561 (2012).
  41. Mestdagh, P., et al. A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization. Genome Biol. 10 (6), 64 (2009).
  42. Montani, F., et al. miR-Test: A Blood Test for Lung Cancer Early Detection. J Natl Cancer Inst. 19 (6), 063 (2015).
  43. Sestini, S., et al. Circulating microRNA signature as liquid-biopsy to monitor lung cancer in low-dose computed tomography screening. Oncotarget. 20 (32), 32868-32877 (2015).
  44. Verri, C., et al. Mutational Profile from Targeted NGS Predicts Survival in LDCT Screening-Detected Lung Cancers. J Thorac. Oncol. (17), 10 (2017).
  45. Bianchi, F., et al. A serum circulating miRNA diagnostic test to identify asymptomatic high-risk individuals with early stage lung cancer. EMBO Mol Med. 3 (8), 495-503 (2011).
  46. Gyoba, J., Shan, S., Roa, W., Bedard, E. L. Diagnosing Lung Cancers through Examination of Micro-RNA Biomarkers in Blood, Plasma, Serum and Sputum: A Review and Summary of Current Literature. Int J Mol Sci. 17 (4), 494 (2016).

Tags

Liquid BiopsyPlasma MiRNALung Cancer ScreeningMicroRNA SignatureEarly DetectionTumor MicroenvironmentRNA IsolationQPCRMolecular Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Mensah, M., Borzi, C., Verri, C., Suatoni, P., Conte, D., Pastorino, U., Orazio, F., Sozzi, G., Boeri, M. MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier (MSC) for Lung Cancer Screening. J. Vis. Exp. (128), e56326, doi:10.3791/56326 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image