Summary

高密度リポタンパク質の脂質過酸化反応の高スループット測定用無細胞生化学的蛍光酵素試金

Published: October 12, 2017
doi:

Summary

HDL 脂質過酸化反応の定量の蛍光細胞生化学アッセイをご紹介します。この迅速かつ再現可能な測定は大規模な研究で HDL 機能を決定するため使用することができ、ヒトの疾患における HDL の機能の私達の理解に貢献することができます。

Abstract

低高比重リポ蛋白コレステロール (HDL-C) は、動脈硬化性心血管疾患 (CVD) の最も強力な独立した否定的な予測因子の 1 つです。HDL-C よりもむしろ HDL の機能と構造は、アテローム性動脈硬化をより正確に予測可能性があります。いくつか HDL タンパク質と脂質組成変化 HDL の機能を損なうことは、動脈硬化症などの炎症性の状態で発生します。HDL 関数通常標準化の多数の欠点不足しているコレステロール排出分析がこれらのアッセイなどの試金に基づくセルによって決定されます。細胞アッセイは、HDL の機能細胞に基づく試金と比較してより強固な対策を与える可能性があります。HDL の酸化は、HDL の機能を損ないます。HDL は、脂質過酸化物の輸送の主要な役割と過酸化脂質の高い金額は HDL の機能異常に関係。脂質プローブの相互作用は、脂質の酸化状態を測定するため試金非酵素的蛍光の結果を解釈するときに考慮されなければなりません。これは内容を査定する HDL 脂質過酸化物 (HDLox) HDL の機能不全に貢献する細胞生化学的酵素法を開発する動機。この手法は酵素西洋わさびの過酸化酵素 (HRP) と螢光色素 (コレステロールオキシダーゼ) なし HDL-C の mg 当たり脂質過酸化物含有量を定量化できます Amplex 赤ここでプロトコルは螢光色素試薬を用いた HDL 脂質過酸化反応の describedfor 決定です。実験条件の厳格な標準化によって試金の変動を削減できます。高い HDLox 値は HDL の抗酸化機能の減少と関連付けられています。このアッセイの読み出しは、心血管疾患、全身性炎症、免疫機能障害、リスク心血管疾患や代謝表現型のサロゲート対策検証セルベースのアッセイのリードアウトに関連付けられます。この技術的なアプローチは、人間の病気、全身性炎症、酸化ストレスおよび酸化脂質 (動脈硬化) などの重要な役割がある HDL 機能を評価する手法です。

Introduction

動脈硬化性心血管疾患 (CVD) は、死の世界1,2の主要な原因です。疫学的研究は、反比例動脈硬化1,2の開発のリスクに関連付けられている一般的に高密度リポタンパク質 (HDL) コレステロールの低レベルを示しています。いくつかの研究は、HDL1,2のため抗動脈硬化の役割をサポートする HDL 減衰開始とアテローム性動脈硬化の進行メカニズムは複雑な3,4です。このように、複雑な構造と絶対レベルではなく、HDL の機能にはアテローム性動脈硬化5,6,7,8より正確に予測可能性が示唆されています。いくつか HDL タンパク質と脂質組成変化 HDL の機能を損なうことは、動脈硬化症などの炎症性の状態で発生します。これらは i) 減らす、コレステロール排出潜在的な9ii) 抗炎症作用と増加 HDL プロ炎症性蛋白67iii) 減少抗酸化因子レベルと活動と Hdl を減少させます。低密度リポタンパク質 (LDLox)10および iv の酸化を抑制する能力) 脂質ヒドロペルオキシド コンテンツおよび酸化還元活性 (HDLox)9,11を増やします。HDL の pleotropic 機能 (コレステロールの排出、抗酸化機能) などを評価する堅牢な試金が HDL-HDL-C クリニックでの定量を補完します。

HDL の機能通常、セルベースの方法コレステロール排出アッセイ8,12,13,14等により評価されます。これらのメソッドには、使用される電池の種類、報告の読み出しの種類、標準化の欠如とトリグリセリド7,15の交絡影響に関して重要な不均一性を含む主要な限界があります。これらの欠点は、大規模臨床研究16の困難をもたらします。細胞アッセイは、HDL の機能細胞に基づく試金と比較してより強固な対策を与える可能性があります。コレステロールの排出は HDL の最も重要な機能の 1 つが、細胞に基づく試金によってのみ決定できます。プロテオミクス17,18,19,20,21,22,など23、HDL の機能を確認する他の方法 24と HDL 機能17,22,25のセルベースの単球走化性アッセイの標準化されていない大規模な人間の研究では使用できません。

HDL が重要な抗酸化抗動脈硬化効果5,6,7,8。HDL の抗酸化機能は、以前携帯無料蛍光アッセイ26で LDL の存在下で決定されています。HDL の抗酸化能をこれらの生化学蛍光メソッドその同僚26とアラン Fogelman モハマド Navab によって開発されました。HDL 機能17,18,19,20,21,22,23 を決定するのにこれらのメソッドを使用している多くの人間研究 ,24脂質 (HDL) ・脂質 (LDL) と脂質螢光相互作用はこれら携帯無料非酵素的生化学的アッセイ HDL 関数27,28の再現性を制限可能性があります。

最近の関心は、脂質および HDL 27,29,30内の蛋白質の酸化の結果である HDL 酸化の機能的な結果を重視しています。先行研究が示されている HDL の酸化 HDL 関数27,29,30を損ないます。HDL は、脂質過酸化物の輸送の主要な役割と過酸化脂質の高い金額は HDL の機能異常に関係。このように HDL 脂質過酸化物含有量を HDL 機能9,17,20,31を決定するために使用、HDL 関数7の前のアッセイの既知の制限を付与できます。 15,27,32, HDL 脂質過酸化物含有量 (HDLox) 32を定量化する代替蛍光法を開発しました。このメソッドは、酵素西洋わさびの過酸化酵素 (HRP) と螢光色素 (コレステロールオキシダーゼ) なしの HDL-C 32mg 当たり脂質過酸化物含有量を定量化できます Amplex 赤に基づいています。アッセイの生化学的原理を図 1に示します。私たちは、この蛍光ベースのアプローチに事前 HDL 機能試金27,28の制限がないことを示しています。この試金をさらに洗練され、凍結プラズマ32,33,34,とも大規模な人間の研究で確実に使えるように、当研究室で標準化35,36,37,38,39,40,41,42このアッセイの読み出しは心血管疾患、全身性炎症、免疫機能障害、心血管疾患や代謝リスク表現型のサロゲート対策検証セルベースのアッセイのリードアウトに関連付けられて。32,33,34,35,36,37,38,39します。 ここでは、HDL の脂質過酸化物含有量 (HDLox) を測定するこの単純な、まだ強力なメソッドについて述べる。この試金することができます、使用することツールとして人間の病気で HDL 機能の役割について重要な研究の質問に答えるため全身性炎症、酸化ストレスおよび酸化脂質32(動脈硬化) など重要な役割。

Protocol

大学からカリフォルニア州ロサンゼルス、ロサンゼルス、メルボルン、アルフレッド病院倫理委員会の承諾を倫理、ひと生体試料を用いたすべての実験を行なった。 注: 螢光色素 HDL 機能アッセイ (見なさい議論) 32 の多くのバリエーションがあります。以下最も一貫性と再現性のある結果を与えるプロトコルについて述べる。アッセイの概要は、<stron…

Representative Results

各 HDL サンプルの 50 μ L は、各ステップ 7.3 同様に追加されます。5 U/mL (0.25 U) は、各ステップ 7.5 同様に追加される HRP 溶液 50 μ L。サンプルはステップ 7.6 のように 37 ° C で 30 分間培養しました。螢光色素試薬 50 μ L、各ステップ 7.7 (300 μ M の最終的な集中) 同様に追加されます。(暗い) の蛍光の読み出しを毎分 120 分以上蛍光プレート リーダー (530/590 nm フィルター) ?…

Discussion

ここで説明したプロトコルでは、アテローム性動脈硬化およびひと疾患における HDL 機能の役割について重要な研究の質問に答えるための強力なツールを提供しています。アッセイは、酵素増幅 (HRP) を用いた HDL-C の mg 当たり HDL 脂質過酸化物含有量を定量化します。この方法は使用される電池の種類、報告の読み出しの種類、標準化の欠如と交絡効果に関して重要な不均一性を含む事前 HDL ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

作者は感謝してこのモデルの以前のイテレーションの開発の重要な役割の Dr モハマド Navab、アラン Fogelman、シュリニヴァーサ ・ レディの仕事を認めます。T.A.A. は、RMIT 大学副-一等書記官のポスドク研究員プログラムによってサポートされます。AJ と AH は、NHMRC プロジェクト助成金 1108792 でサポートされます。TK に支えられて NIH 助成金 NIH K08AI08272、NIH/NCATS グラント # µL1TR000124。

Materials

Experimental Reagents
HDL PEG (Polyethylene Glycol) Precipitating Reagent Pointe Scientific H7511
Amplex Red reagent. Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
DMSO. Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
Horse Radish Peroxidase (HRP) Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
Cholesterol Esterase. Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
 Cholesterol Reference standard Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
 Resorufin fluorescense Reference standard Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
5x Reaction Buffer. Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
HDL Cholesterol Automated Reagent ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. TR39601
Name Company Catalog Number Comments
Plasticware 
96-well plates (polypropylene, flat bottom, clear). Sigma Aldrich M0687
96-well plates (polypropylene, flat bottom, black). Sigma Aldrich M9936
1.5 mL Eppendorf tubes Eppendorf 0030 125.150
ClipTip 200, sterile ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. 14-488-058
Thermo Scientific Multichannel Pipettes, 8-channel, 125  ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.  14-387–955
Name Company Catalog Number Comments
Software 
Gen5 2.01 software Biotek, Vermont, USA NA
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Gen5 Plate reader Biotek, Vermont, USA NA

References

  1. Gordon, D. J., Rifkind, B. M. High-density lipoprotein–the clinical implications of recent studies. N Engl J Med. 321, 1311-1316 (1989).
  2. Rubins, H. B., et al. Gemfibrozil for the secondary prevention of coronary heart disease in men with low levels of high-density lipoprotein cholesterol. Veterans Affairs High-Density Lipoprotein Cholesterol Intervention Trial Study Group. N Engl J Med. 341, 410-418 (1999).
  3. Voight, B. F., et al. Plasma HDL cholesterol and risk of myocardial infarction: a mendelian randomisation study. Lancet. 380, 572-580 (2012).
  4. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat.Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
  5. Navab, M., et al. The double jeopardy of HDL. Ann Med. 37, 173-178 (2005).
  6. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Anantharamaiah, G. M., Fogelman, A. M. The role of dysfunctional HDL in atherosclerosis. J Lipid Res. 50, S145-S149 (2009).
  7. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
  8. Patel, S., et al. Reconstituted high-density lipoprotein increases plasma high-density lipoprotein anti-inflammatory properties and cholesterol efflux capacity in patients with type 2 diabetes. J Am Coll Cardiol. 53, 962-971 (2009).
  9. Navab, M., et al. HDL and the inflammatory response induced by LDL-derived oxidized phospholipids. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21, 481-488 (2001).
  10. Hayek, T., Oiknine, J., Brook, J. G., Aviram, M. Role of HDL apolipoprotein E in cellular cholesterol efflux: studies in apo E knockout transgenic mice. Biochem Biophys Res Commun. 205, 1072-1078 (1994).
  11. Van Lenten, B. J., et al. Anti-inflammatory HDL becomes pro-inflammatory during the acute phase response. Loss of protective effect of HDL against LDL oxidation in aortic wall cell cocultures. J Clin Invest. 96, 2758-2767 (1995).
  12. Undurti, A., et al. Modification of high density lipoprotein by myeloperoxidase generates a pro-inflammatory particle. J Biol Chem. 284, 30825-30835 (2009).
  13. Van Lenten, B. J., et al. Lipoprotein inflammatory properties and serum amyloid A levels but not cholesterol levels predict lesion area in cholesterol-fed rabbits. J Lipid Res. 48, 2344-2353 (2007).
  14. Watson, C. E., et al. Treatment of patients with cardiovascular disease with L-4F, an apo-A1 mimetic, did not improve select biomarkers of HDL function. J Lipid Res. 52, 361-373 (2011).
  15. Annema, W., et al. Impaired HDL cholesterol efflux in metabolic syndrome is unrelated to glucose tolerance status: the CODAM study. Sci Rep. 6, 27367 (2016).
  16. Movva, R., Rader, D. J. Laboratory assessment of HDL heterogeneity and function. Clin Chem. 54, 788-800 (2008).
  17. Charles-Schoeman, C., et al. Abnormal function of high-density lipoprotein is associated with poor disease control and an altered protein cargo in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 60, 2870-2879 (2009).
  18. Imaizumi, S., et al. L-4F differentially alters plasma levels of oxidized fatty acids resulting in more anti-inflammatory HDL in mice. Drug Metab Lett. 4, 139-148 (2010).
  19. Khera, A. V., et al. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364, 127-135 (2011).
  20. Morgantini, C., et al. Anti-inflammatory and antioxidant properties of HDLs are impaired in type 2 diabetes. Diabetes. 60, 2617-2623 (2011).
  21. Patel, P. J., Khera, A. V., Jafri, K., Wilensky, R. L., Rader, D. J. The anti-oxidative capacity of high-density lipoprotein is reduced in acute coronary syndrome but not in stable coronary artery disease. J Am Coll Cardiol. 58, 2068-2075 (2011).
  22. Watanabe, J., et al. Proteomic profiling following immunoaffinity capture of high-density lipoprotein: association of acute-phase proteins and complement factors with proinflammatory high-density lipoprotein in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 64, 1828-1837 (2012).
  23. Watanabe, J., et al. Differential association of hemoglobin with proinflammatory high density lipoproteins in atherogenic/hyperlipidemic mice. A novel biomarker of atherosclerosis. J Biol Chem. 282, 23698-23707 (2007).
  24. Watanabe, J., et al. Hemoglobin and its scavenger protein haptoglobin associate with apoA-1-containing particles and influence the inflammatory properties and function of high density lipoprotein. J Biol Chem. 284, 18292-18301 (2009).
  25. Wang, X. S., et al. A sensitive and specific ELISA detects methionine sulfoxide-containing apolipoprotein A-I in HDL. J Lipid Res. 50, 586-594 (2009).
  26. Navab, M., et al. A cell-free assay for detecting HDL that is dysfunctional in preventing the formation of or inactivating oxidized phospholipids. J Lipid Res. 42, 1308-1317 (2001).
  27. Kelesidis, T., et al. A biochemical fluorometric method for assessing the oxidative properties of HDL. J Lipid Res. 52, 2341-2351 (2011).
  28. Kelesidis, T., et al. Effects of lipid-probe interactions in biochemical fluorometric methods that assess HDL redox activity. Lipids Health Dis. 11, 87 (2012).
  29. Navab, M., et al. Mechanisms of disease: proatherogenic HDL–an evolving field. Nat Clin Pract Endocrinol Metab. 2, 504-511 (2006).
  30. Navab, M., et al. The oxidation hypothesis of atherogenesis: the role of oxidized phospholipids and HDL. J Lipid Res. 45, 993-1007 (2004).
  31. Morgantini, C., et al. HDL lipid composition is profoundly altered in patients with type 2 diabetes and atherosclerotic vascular disease. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 24, 594-599 (2014).
  32. Kelesidis, T., et al. A high throughput biochemical fluorometric method for measuring lipid peroxidation in HDL. PLoS One. 9, e111716 (2014).
  33. Kelesidis, T., Yang, O. O., Kendall, M. A., Hodis, H. N., Currier, J. S. Dysfunctional HDL and progression of atherosclerosis in HIV-1-infected and -uninfected adults. Lipids Health Dis. 12, 23 (2013).
  34. Zanni, M. V., et al. HDL redox activity is increased in HIV-infected men in association with macrophage activation and non-calcified coronary atherosclerotic plaque. Antivir Ther. 19, 805-811 (2014).
  35. Roberts, C. K., Katiraie, M., Croymans, D. M., Yang, O. O., Kelesidis, T. Untrained young men have dysfunctional HDL compared with strength-trained men irrespective of body weight status. J Appl Physiol (1985). , 1043-1049 (2013).
  36. Davidson, W. S., et al. Weight loss surgery in adolescents corrects high-density lipoprotein subspecies and their function. Int J Obes (Lond). 41, 83-89 (2017).
  37. Kelesidis, T., et al. Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals. J Acquir Immune Defic Syndr. , (2017).
  38. Kelesidis, T., et al. Oxidized lipoproteins are associated with markers of inflammation and immune activation in HIV-1 infection. AIDS. 30, 2625-2633 (2016).
  39. Kelesidis, T., et al. Changes in plasma levels of oxidized lipoproteins and lipoprotein subfractions with atazanavir-, raltegravir-, darunavir-based initial antiviral therapy and associations with common carotid artery intima-media thickness: ACTG 5260s. Antivir Ther. , (2016).
  40. Bhattacharyya, D. K., Adak, S., Bandyopadhyay, U., Banerjee, R. K. Mechanism of inhibition of horseradish peroxidase-catalysed iodide oxidation by EDTA. Biochem J. 295 (Pt 2), 281-288 (1994).
  41. Rees, M. D., Pattison, D. I., Davies, M. J. Oxidation of heparan sulphate by hypochlorite: role of N-chloro derivatives and dichloramine-dependent fragmentation. Biochem J. 391, 125-134 (2005).
  42. Mani, K., Cheng, F., Fransson, L. A. Heparan sulfate degradation products can associate with oxidized proteins and proteasomes. J Biol Chem. 282, 21934-21944 (2007).
  43. Finley, P. R., Schifman, R. B., Williams, R. J., Lichti, D. A. Cholesterol in high-density lipoprotein: use of Mg2+/dextran sulfate in its enzymic measurement. Clin Chem. 24, 931-933 (1978).
  44. von Schenck, H., Jacobsson, M. L. Prothrombin assay standardized with an international normalization ratio (INR): goal and reality. Clin Chem. 33, 342 (1987).
  45. de Kok, J. B., et al. Normalization of gene expression measurements in tumor tissues: comparison of 13 endogenous control genes. Lab Invest. 85, 154-159 (2005).
  46. Stocker, R., Keaney, J. F. Role of oxidative modifications in atherosclerosis. Physiol Rev. 84, 1381-1478 (2004).
  47. Holzer, M., et al. Aging affects high-density lipoprotein composition and function. Biochim Biophys Acta. 1831, 1442-1448 (2013).
  48. Amundson, D. M., Zhou, M. Fluorometric method for the enzymatic determination of cholesterol. J Biochem Biophys Methods. 38, 43-52 (1999).
  49. Mishin, V., Gray, J. P., Heck, D. E., Laskin, D. L., Laskin, J. D. Application of the Amplex red/horseradish peroxidase assay to measure hydrogen peroxide generation by recombinant microsomal enzymes. Free Radic Biol Med. 48, 1485-1491 (2010).
  50. Lombardi, A., et al. UCP3 translocates lipid hydroperoxide and mediates lipid hydroperoxide-dependent mitochondrial uncoupling. J Biol Chem. 285, 16599-16605 (2010).
  51. Bhattacharya, A., et al. Denervation induces cytosolic phospholipase A2-mediated fatty acid hydroperoxide generation by muscle mitochondria. J Biol Chem. 284, 46-55 (2009).
  52. Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of µLtracentrifugally separated lipoproteins in human serum. J Clin Invest. 34, 1345-1353 (1955).
  53. Dyerberg, J. Comments on the quantitation of lipoproteins by agarose-gel electrophoresis. Clin Chim Acta. 61, 103-104 (1975).
  54. Warnick, G. R., Cheung, M. C., Albers, J. J. Comparison of current methods for high-density lipoprotein cholesterol quantitation. Clin Chem. 25, 596-604 (1979).
  55. Demacker, P. N., Hijmans, A. G., Vos-Janssen, H. E., van’t Laar, A., Jansen, A. P. A study of the use of polyethylene glycol in estimating cholesterol in high-density lipoprotein. Clin Chem. 26, 1775-1779 (1980).
  56. Izzo, C., Grillo, F., Murador, E. Improved method for determination of high-density-lipoprotein cholesterol I. Isolation of high-density lipoproteins by use of polyethylene glycol 6000. Clin Chem. 27, 371-374 (1981).
  57. Patel, P. J., Khera, A. V., Wilensky, R. L., Rader, D. J. Anti-oxidative and cholesterol efflux capacities of high-density lipoprotein are reduced in ischaemic cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 15, 1215-1219 (2013).
  58. Roche, M., Rondeau, P., Singh, N. R., Tarnus, E., Bourdon, E. The antioxidant properties of serum albumin. FEBS Lett. 582, 1783-1787 (2008).
  59. Panzenbock, U., Kritharides, L., Raftery, M., Rye, K. A., Stocker, R. Oxidation of methionine residues to methionine sulfoxides does not decrease potential antiatherogenic properties of apolipoprotein A-I. J Biol Chem. 275, 19536-19544 (2000).

Play Video

Cite This Article
Sen Roy, S., Nguyen, H. C. X., Angelovich, T. A., Hearps, A. C., Huynh, D., Jaworowski, A., Kelesidis, T. Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein. J. Vis. Exp. (128), e56325, doi:10.3791/56325 (2017).

View Video