Summary

体外骨髓源性巨噬细胞对髓鞘碎片的吞噬

Published: December 30, 2017
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Summary

本文采用荧光标记髓鞘碎片和胞内脂滴染色的方法, 对小鼠骨髓源性巨噬细胞的吞噬能力进行评估。

Abstract

骨髓源性巨噬细胞 (BMDMs) 是成熟的白细胞, 具有重要的生理作用, 作为专业吞噬能够清除各种微粒。正常情况下, BMDMs 受中枢神经系统 (CNS) 的限制, 但在受伤后, 他们可以很容易地渗入。一旦在受损的中枢神经组织内, BMDMs 是主要的细胞类型, 负责清除损伤衍生的细胞碎片, 包括大量的富含脂质的髓鞘碎片。中枢神经系统内 BMDM 浸润和髓鞘碎片吞噬的病理影响是复杂的, 不太清楚。这里描述的协议, 允许直接的体外研究 BMDMs 在中枢神经系统损伤的情况下。我们覆盖小鼠 BMDM 分离和培养, 髓鞘碎片制备, 并测定 BMDM 髓鞘碎片吞噬功能。这些技术在不需要重要的专用设备或材料的情况下产生可靠的可量化结果, 但可以很容易地定制以满足研究人员的需要。

Introduction

骨髓源性巨噬细胞 (BMDMs) 是先天和适应性免疫系统之间的重要联系。作为抗原呈递细胞 (apc), 他们可以通过抗原呈递和细胞因子释放1,2,3与淋巴细胞进行通信。然而, 作为专业吞噬, 他们的主要功能是清除病原体, 衰老细胞和细胞碎片1,4。继脊髓损伤 (SCI), 大量髓鞘碎片是由死亡的突, 细胞类型负责中枢神经系统轴突鞘5。我们和其他人已经表明, 清除髓鞘碎片主要是渗透 BMDMs 的责任5,6,7。然而, 在脊髓损伤部位吞没髓鞘碎片被建议将这些正常的抗炎细胞转变为炎状态5,8,9。BMDMs 是脊髓损伤中神经炎症的重要介质, 是临床的主要靶点。

为了帮助研究 BMDMs 在损伤脊髓中的影响, 我们开发了一个体外模型, 直接探讨 BMDMs 对髓鞘碎片的反应。为了提高生物学相关性, 在这些调查中使用了小鼠 BMDMs 和新近分离的髓鞘碎片。因此, 这里介绍的方法也详述了原小鼠 BMDMs 的分离和培养, 以及用于分离鼠中枢神经系统衍生髓鞘碎片的改良蔗糖梯度技术10,11,12。髓鞘碎片可以很容易地标记为荧光染料, 羧基琥珀酰亚胺酯 (CFSE), 以跟踪其内部化的 BMDMs. CFSE 是非常适合这个应用, 因为它是 non-cytotoxic, 其狭窄的荧光光谱允许多路传输与其他荧光探针13,14。继吞噬后, 髓鞘碎片脂通过溶酶体转运, 并以中性脂质包装成细胞内脂滴5。为了量化这种细胞内脂质的积累, 我们提出了一个油红 O (破产) 染色方法优化定量图像分析。这个简单的染色方法产生可靠的重现性结果和量化的15。这些方法有助于研究的髓鞘碎片吞噬和脂质保留与有限的专用设备。

Protocol

在这里和2节中描述的方法已得到佛罗里达州立大学动物保育和使用委员会 (IACUC) 的批准, 并遵循《实验室动物护理和使用指南》中规定的指南, 8th版.在这个协议中使用的所有动物都是在一个专门的实验室动物设施的房子, 直到使用。没有在体内试验是在牺牲之前进行的。动物数量是根据实验需要使用平均细胞和髓鞘收集作为指导, 以尽量减少使用。 …

Representative Results

BMDMs 的 CFSE 标记髓鞘碎片的治疗应产生清晰的内部化 (图 2)。虽然3小时的互动时间是足够的 BMDMs, 以吞噬足够的补充髓鞘碎片, 为强健的下游检测, 细胞内积累可以观察到, 只需1小时的互动。然而, 一些髓鞘碎片可能仍然存在于细胞表面洗涤后。这可能是由于洗涤不足, 或在吞噬的早期阶段没有完全内化的微粒。 虽然 BMDMs 可以迅速地将髓鞘碎片化, 但在破?…

Discussion

这里描述的程序利用了新分离的原始的中枢神经系统髓鞘碎片和原发骨髓巨噬细胞。为了减少动物的开支, 我们建议在牺牲时从每只老鼠身上采集大脑和骨髓细胞。两位研究人员一起工作可以同时准备两种材料。另外, 在-80 ° c 的 PBS 中, 大脑可以在髓鞘碎片隔离之前用抗生素补充。我们的经验是, 大脑可以在这些条件下维持1月, 而不会有明显的髓鞘碎片生成潜能的损失。

CFSE ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

作者想感谢苏联医学院的媒体专家, 他在视频制作、编辑和配音方面的工作。

这项工作得到了国家卫生研究院 (R01GM100474 和 R01GM072611) 的支持。

Materials

DMEM GE Healthcare Life Sciences SH30243.01 High glucose with L-glutamine, sodium pyruvate
Penicillin-Streptomycin Solution Corning 30-002-CI 100X Solution
New Born Calf Serum (NCS) Rocky Mountain Biologics NBS-BBT-5XM United States Origin
NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L]  ATCC CCL-1 L929 Cell Line of Conditioned Media Preparation
24-well Cell Culture Plates VWR 10062-896 
Cell Culture Dish Greiner Bio-One 639960 Polystyrine, 145/20mm
CFSE Cell Proliferation Kit Thermo Fisher C34570 DMSO for Reconsitution Provided
Fluoro-gel with Tris Buffer  Electron Microscopy Sciences 17985-11
Oil Red O Sigma Aldrich O0625
Equipment
Materials Company Catalog Number Comments
Ultracentrifuge Tubes Beckman Coulter 326823 Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm
SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor Beckman Coulter 369650 SW 32 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium
Hand Held Rotary Homogenizer Fisher Science 08-451-71

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Rolfe, A. J., Bosco, D. B., Broussard, E. N., Ren, Y. In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (130), e56322, doi:10.3791/56322 (2017).

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