Imaging neurale activiteit in de primaire somatosensorische Cortex met behulp van Thy1-GCaMP6s transgene muizen
Summary
We beschrijven een experimentele procedure voor het meten van neuronale activiteit door dual optische ramen boven bilaterale primaire somatosensorische corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgene muizen met behulp van 2-foton (2 P) microscopie in vivo.
Abstract
De hersenen van zoogdieren vertoont duidelijke symmetrie in het sagittale vlak. Gedetailleerde beschrijving van neurale dynamiek in symmetrische hersengebieden in volwassen zoogdieren dieren blijft echter ongrijpbaar. In deze studie, beschrijven we een experimentele procedure voor het meten van calcium dynamiek door dual optische ramen boven bilaterale primaire somatosensorische corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgene muizen met behulp van 2-foton (2 P) microscopie. Deze methode maakt opnamen en ondermeer van neurale activiteit in bilaterale muis hersengebieden één tegelijkertijd in hetzelfde experiment voor een langdurige periode in vivo. Belangrijke aspecten van deze methode, die kan worden voltooid binnen een uur, omvatten minimaal invasieve chirurgieprocedures voor het maken van dual optische windows, en het gebruik van 2P imaging. Hoewel we alleen de techniek op het gebied van S1 tonen, kan de methode worden toegepast voor andere regio’s van het levende brein te vergemakkelijken van de opheldering van structurele en functionele complexiteit van hersenen neurale netwerken.
Introduction
Calcium en de verordening zijn essentieel in het bemiddelen van meerdere fysiologische processen. Controle van de dynamiek van calcium is nuttig voor het begrijpen van de normale hersenfunctie evenals pathologische condities van hersenen stoornissen 1,2,3,4,5,6 ,7,8. Imaging GCaMP6s fluorescentie is een krachtig hulpmiddel voor het kwantificeren van de spike nummers, timing, en de frequentie, alsmede de niveaus van synaptic inbreng zowel in vitro als in vivo 9,10,11.
De hersenen van zoogdieren vertoont duidelijke symmetrie in het sagittale vlak. Hoewel recente neurologische onderzoek licht op de corticale remodelleren werpen heeft en neuronale activiteit getriggerd door traumatische hersenen of ruggenmerg letsel 6,7, de rollen die intact weefsel van symmetrisch spelen overeenkomstige regio ‘s in herstel zijn nog steeds onduidelijk.
In deze studie beschrijven we experimentele procedures voor het maken van bilaterale symmetrische optische windows voor in vivo imaging. Deze optische windows gebruikt, beschrijven we het meten van calcium dynamiek van primaire somatosensorische cortices (S1) in GCaMP6s transgene muizen met behulp van 2P microscopie. In de sectie resultaten tonen we ook in vivo dendritische morfologie op verschillende tijdstippen in de regio van de S1 in de EGFP transgene muizen met behulp van 2 P imaging. De observatie-methode met betrekking tot de dynamiek van het netwerk in de bilaterale S1 gebieden is maar een eerste voorbeeld van hoe dual open craniale windows zal helpen neurowetenschappers sonde lokale en symmetrische informatieverwerking in de hersenen volwassen zoogdieren in de normale omstandigheden of in andere ziekte modellen in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Twee-foton imaging kunt de gelijktijdige meting van de activiteit van veel cellen op een redelijke resolutie op tot ongeveer 800 µm onder het oppervlak van de hersenen. Wij 2P en een dual optische venster techniek geïntegreerd met genetisch gecodeerde GCaMP6s te observeren dynamiek van de calcium in populaties van neuronale waarin laag V gelegen > 500 µm onder de pia. Met een open optische venster op elke zijde van de schedel kunt de methode opnames van neurale activiteit over symmetrische zoogdieren hersengebieden op langdurige en stabiele calcium in vivoimaging. Belangrijke aspecten van deze methode opnemen de prestaties van minimaal invasieve chirurgie maken dubbele open schedel optische windows en 2P beeldvorming van neuronale activiteit in symmetrische S1 regio’s.
Behandeling van de netwerkactiviteit in bilaterale S1 regio’s is dat een voorbeeld van hoe dual craniale windows kan worden gebruikt om lokale en symmetrische informatieverwerking in de volwassen hersenen in vivosonde. Deze methode kan ook worden gebruikt om de neuronale activiteit (bijvoorbeeld met behulp van Thy1 –GCaMP6s muizen) en corticale plasticiteit B6 te studeren. CG-Tg (Thy1– YFP) HJrs/J van intact weefsel van de corresponderende symmetrische regio’s in de rustfase na deafferentation als gevolg van een eenzijdige CNS blessure. De methode kan ook worden gebruikt om te onderzoeken van de corticale activiteit in reactie op de stimulatie van de perifere strategieën zoals optogenetic, elektrische of chemische stimulaties. Hoewel we alleen de techniek op het gebied van S1 tonen, kan deze aanpak worden toegepast teneinde te onderzoeken van de activiteiten in andere symmetrische gebieden in de hersenen van het leven zoals de laag V neuronen van de primaire motorische cortex (M1). Opmerkingen over reorganisatie van hersengebieden kunnen voorzien van een neuraal substraat adaptieve motor gedrag, die een cruciale rol in postinjury herstel van functie speelt. Het staat ook voor chronische meting van de symmetrische activiteit van genetisch geïdentificeerde cellen tijdens gedrag in hoofd-vaste muizen.
Technisch, onderzoekers moeten zorgvuldig aandacht besteden aan de kwaliteit en consistentie van dual craniale windows. Uitgedund-schedel craniale venster techniek 12 is een aanrader voor de beginners om te oefenen. Stekels zijn calcium compartimenten vanwege hun morfologie en lokale toestroom en extrusie mechanismen. In deze studie gebruikten we B6. CG-Tg (Thy1– YFP) HJrs/J muizen als voorbeeld om aan te tonen Dendritische spine dynamiek in vivo (Figuur 4). Een open-schedel glazen venster installatie kan veroorzaken hoge rug omzet en reactieve gliale reacties na chirurgie 12. In tegenstelling met de techniek uitgedund-schedel venster stekels en dendrites kunnen worden goed bewaard gebleven.
Keuzen van afmetingen en diktes van optische windows zullen afhankelijk van het gewenste gezichtsveld, de kromming van de schedel, de dikte van de schedel en het soort imaging 13. Onvoldoende druk van de optische coverglasses op de dura kan verdikking van de dura, hergroei van de schedel, en verhoogd hersenen beweging. Daarentegen kan de buitensporige druk van de optische coverglasses corticale bloedstroom belemmeren.
Voor de assemblage van de optische venster, lijm en genezen van extra lagen van coverglasses een op een moment met optische lijm- en lange-golflengte UV-licht. Warm om te helpen versterken van de verlijming, het verzonnen venster (50 ° C voor 12 h) in een broedmachine. Sla de optische venster dekglaasje in ethanol 70% (vol/vol) en vóór de operatie, het spoelen met een steriele zoutoplossing. Het optische venster moet worden onderzocht op hun onvolkomenheden (zoals een onjuist bedrag van optische uitlijning van de zelfklevende of onjuiste) onder een stereoscoop vóór gebruik te voorkomen van mislukking. Als de optische lijm te dun is, kan luchtruimten worden gevouwen, die leiden optische aberraties of dekking glas Detachement bij de implantatie tot kan. Daarentegen kan teveel optische lijm overloop langs de randen van de craniale venster.
Kortom, hier beschrijven we een experimentele procedure voor het meten van calcium dynamics of dendritische morfologie door craniale ramen uit 2 symmetrische primaire somatosensorische corticale gebieden in Thy1-GCaMP6s en Thy1– YFP transgene muizen, respectievelijk het gebruik van 2P microscopie. Deze techniek kan sterk vergemakkelijken ontrafeling van het complexe structurele en functionele relatie van neurale netwerken.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn zeer dankbaar Wenbiao Gan (Skirball Institute, departement van fysiologie en Neuroscience, New York University School of Medicine, USA) voor uitstekende technische begeleiding en Patti Raley, medische Editor (departement van de Neurochirurgie, Indiana University School of Medicine), voor het bewerken van het manuscript. Wij danken Dr. Jinhui Chen (Stark neurowetenschappen Research Institute, Indiana University School of Medicine, USA) voor het verstrekken van B6. CG-Tg (Thy1– YFP) HJrs/J muizen. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Stichting van de directeur van het algemene ziekenhuis van Jinan militaire regio van Ruggegraten PLA 2016ZD03 (XJL), en NIH NS059622, NS073636, DOD CDMRP W81XWH-12-1-0562, verdienste Review Award I01 BX002356 van het US Department of Veterans Zaken, Craig H Neilsen Foundation 296749, Indiana ruggenmerg en hersenen verwonding Research Foundation, Mari Hulman George Endowment fondsen (XMX).
Materials
| C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6s)GP4.3Dkim/J | Jackson | 24275 | Can be any strains made by the genetically-encoded neuronal indicator and effector expressing the green fluorescent calcium indicator, GCaMP, in subsets of excitatory neurons in the cortex. |
| B6.Cg-Tg(Thy1-EGFP)OJrs/GfngJ. | Jackson | 7919 | Can be any strains expressing EGFP in subsets of neurons within specific populations in the cortex; providing a bright, vital Golgi-like stain. |
| Dumont no. 5 forceps, standard, Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | Can be any brand of choice. |
| Dumont no. 5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Can be any brand of choice. |
| Micro Bead Sterilizer | Southern Labware | B1201 | Can be any brand of choice. |
| Harishige’s SG-4N Head Holding Adaptor | Tritech Research | SG-4N | Can be any brand of choice. |
| Ideal Micro-Drill Complete Kit | Harvard Apparatus | 72-6065 | Can be any brand of choice. |
| Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19007-05 | Can be any brand of choice. |
| Round cover glass, 3 mm | Harvard Biosciences | W4 64-0720 | Can be any brand of choice. |
| Round cover glass, 5 mm | Harvard Biosciences | W4 64-0700 | Can be any brand of choice. |
| Norland optical adhesive | Norland Products | 7106 | Can be any brand of choice. |
| Loctite liquid super glue | WB Mason | LOC1647358 | Can be any brand of choice. |
| Grip cement kit, powder and solvent | Dentsply | 675570 | Can be any brand of choice. Mix 5 parts of white dental cement powder (Grip Cement) with one part of black Tempera powder paint (to shield from light; some users prefer a 10:1 ratio). |
| Gel foam | Moore Medical | 2928 | Can be any brand of choice. |
| Micro dissecting scissors | Roboz | RS-5841 | Can be any brand of choice. |
| Artificial cerebrospinal fluid (ASF) | – | – | The ACSF contains 125 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 and 20 mM glucose. Bubble the ACSF with oxygen (95% oxygen, 5% carbon dioxide) and adjust the pH to 7.4. Prepare fresh ACSF solution before every experiment. |
References
- Cichon, J., Gan, W. B. Branch-specific dendritic Ca(2+) spikes cause persistent synaptic plasticity. Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).
- Andermann, M. L., Kerlin, A. M., Roumis, D. K., Glickfeld, L. L., Reid, R. C. Functional specialization of mouse higher visual cortical areas. Neuron. 72 (6), 1025-1039 (2011).
- Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo. Nature. 475 (7357), 501-505 (2011).
- Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nat Neurosci. 14 (8), 1089-1093 (2011).
- Katona, G., et al. Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes. Nat Methods. 9 (2), 201-208 (2012).
- Zhang, K., et al. Remodeling the Dendritic Spines in the Hindlimb Representation of the Sensory Cortex after Spinal Cord Hemisection in Mice. PLoS One. 10 (7), e0132077 (2015).
- Keck, T., et al. Synaptic scaling and homeostatic plasticity in the mouse visual cortex in vivo. Neuron. 80 (2), 327-334 (2013).
- Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A miniature head-mounted two-photon microscope. high-resolution brain imaging in freely moving animals. Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).
- Scott, B. B., Brody, C. D., Tank, D. W. Cellular resolution functional imaging in behaving rats using voluntary head restraint. Neuron. 80 (2), 371-384 (2013).
- Luongo, F. J., Horn, M. E., Sohal, V. S. Putative Microcircuit-Level Substrates for Attention Are Disrupted in Mouse Models of Autism. Biol Psychiatry. 79 (8), 667-675 (2016).
- Wachowiak, M., et al. Optical dissection of odor information processing in vivo using GCaMPs expressed in specified cell types of the olfactory bulb. J Neurosci. 33 (12), 5285-5300 (2013).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat Protoc. 5 (2), 201-208 (2010).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nat Protoc. 9 (11), 2515-2538 (2014).
