G2-seq: 높은 처리량 시퀀싱 기반 기술을 늦게 게놈의 복제 확인
Summary
Cytometry 및 높은 처리량 연속 게놈 늦게 복제 영역을 식별 하는 기술을 설명 합니다.
Abstract
DNA 복제는 세포 주기의 S 단계의 진행에 따라 수많은 기술 개발 되었습니다. 이러한 기술의 대부분의 위치 및 게놈 중복 보다는 그것의 완료의 개시의 타이밍으로 지시 되어 있다. 그러나, 그것은 우리가이 지역 돌연변이, 염색체 파손의 높은 수준의 고통 때문에 마지막 복제를 완료 하는 게놈의 지구를 이해 하 고 그들은 질병과 노화와 연관 된 중요 한. 여기 우리는 어떻게 우리가 대신 마지막 완전 한 복제에 게놈의 그 영역을 식별에 복제 개시를 모니터링 하는 데 사용 된 기술 확장을 설명 합니다. 이 방법은 cytometry 및 높은 처리량 시퀀싱의 조합을 기반으로 합니다. 이 보고서에서는 효 모에이 기술 적용, 접근 교류 cytometer DNA 내용에 따라 정렬 될 수 있는 모든 세포와 함께 사용할 수 있습니다.
Introduction
진 핵 게놈 복제 복제, 복제에서 포크 (Fragkos 그 외 여러분, 20151에서 검토) 두 방향에서 진행의 기원 이라고 하는 여러 개별 사이트에서 시작 됩니다. 기원 그들의 타이밍 및 발사의 효율성에서 변화 하 고 몇 가지 기술을 복제 원점 활동을 모니터링 하 고이 변화의 원인 명료 하도록 개발 되었습니다. 개별 근원의 활동의 단일 가닥 DNA2, 활성 기원, 주위는 양식 수준에서 추정 될 수 있다 또는 특정 복제 중간체3모니터를 2 차원 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 둘 다로 검출 될 수 있다 방사성 조사 합니다. 이러한 기술을 모두 기원 전에 특정 알려진된 시퀀스에 제한 때문에 더 쉽게 S. cerevisiae 보다 포유류 세포에 적용 됩니다. Microarrays의 도래와 함께 세계적으로 발사 하는 근원 평가 수 되었다. 이 하 여 무거운 동위 원소와 DNA 라벨, 셀 g 1 블록에서 중간 포함 가벼운 동위 원소에 다음 무거운-가벼운 하이브리드 DNA 게놈4에 걸쳐 형성 모니터링 처음 이루어졌다. 높은 처리량 시퀀싱의 소개 허용 비슷한 게놈 넓은 비싼 동위 원소 라벨의 요구 없이 원산지 활동의 모니터링. 세포는 DNA 내용에 따라 교류 cytometer 및 깊은 시퀀싱을 복종 하는 그들의 DNA에 정렬 했다. 시퀀스 범위 S 단계에 걸쳐 2 x 1 x에서 진행, 때문에 상대 복제 타이밍 G1 또는 g 25,6에 S 단계에 있는 세포의 읽기 깊이 비교 하 여 평가 될 수 있습니다. 특히 효 모에 적용 되는 이러한 기술을 어떻게 DNA 순서, chromatin 구조, 그리고 DNA 복제 단백질 근원 타이밍 및 효율성 규제에 대 한 깊은 이해로 이끌어 냈다.
세포질 확산 중 유전 정보의 충실 한 전송 기원에 이루어지는 DNA 복제의 성공 뿐만 아니라 개시 뿐만 아니라 발생 하는 복제 포크 만나는 복제 성공적으로 완료 해야 합니다. 복제의 개시, 같은 복제의 완료의 타이밍 남은 세포 주기에서 늦게도 복제 되지 않은 특정 지역으로 게놈에 걸쳐 다릅니다. 이러한 지역 특히 활성 복제 기원에서 멀리 떨어져 있을 수 있습니다 또는 시퀀스 또는 DNA polymerases를 방해 하는 염색 질 구조를 포함할 수 있습니다. 늦게 영역 복제 염색체 파손 및 높은 돌연변이 속도와 연결 하 고 암과 노화7,,89에 연루 되어 연약한 사이트로 자신을 나타날 수 있습니다. 그러나, 게놈 안정성의 유지 보수에 DNA 복제의 적절 한 완료의 중요성에도 불구 하 고이 일어난 어디서 및 어떻게의 우리의 이해는 복제 개시의 뒤에 멀리 느껴 지. 그리고 개별 유전자의 늦은 복제 질병과 연관 되었습니다 동안 연구 함께, 예를 들어 정량10, 글로벌 연구 elucidating 위치 및 기본 복제는 부족의 원인에서 감독. 여기는 우리가 “G2 seq”는 우리가 결합 cytometry에 게놈 복제의 완료에 빛을 발산 하는 높은 처리량 시퀀싱으로 효 모11을 참조 하는 기술에 설명 합니다. 사소한 변경,이 프로토콜 흐름 DNA 내용에 따라 정렬 될 수 있는 모든 셀에 적응 될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 기술은 강력 하 고 비교적 똑 바른 동안 앞으로, 특정 주의 다음에 전념 한다.
(1) 문화 차이 매니페스트 세포 주기 배포판에 문화는 접종 후 원하는 밀도 그냥 4 h를 도달 하는 데 후 수확 하는 경우 이후 로그 단계를 도달 하기 전에 적어도 12 h에 대 한 성장 좋습니다. 우리의 가정은 세포 주기 분포는 비교적 안정 된 평형에 도달 했습니다 더 나타내는 “진짜” 로그 단계 배포?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품 A.B. 부여 NIH GM117446에 의해 지원 되었다
Materials
| YeaStar Genomic DNA kit | Genesee Scientific | 11-323 | |
| 1 µM SYTOX Green | ThermoFisher | 57020 | resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2 |
| 50 mM sodium citrate, pH 7.2 | |||
| RNase solution (0.25 mg / mL) | Sigma | R6513 | 0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20° |
| proteinase K solution (20 mg / mL) | ThermoFisher / Invitrogen | 25530-015 | resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20°C |
| Model 50 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB50A220 | |
| BD Biosciences FACSAria II | BD Biosciences | 644832 | |
| Zymo-spin III columns | Zymo Research | C1005 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32851 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | |
| Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator | Covaris | 500219 | |
| Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit | Illumina | 15026486 | |
| Illumina HiSeq 2500 instrument | Illumina | SY–401–2501 | |
| gsnap alignment software | open source software / Genentech | http://research-pub.gene.com/gmap |
References
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