Imaging dell'amiloide tessuti macchiati con luminescenti oligotiofeni coniugati di Hyperspectral confocale microscopia e fluorescenza Lifetime Imaging
Summary
Deposito dell’amiloide è un segno distintivo di diverse malattie e affligge molti organi diversi. Questo articolo descrive l’applicazione della fluorescenza luminescenti oligotiofenici coniugati macchiatura in combinazione con tecniche di microscopia di fluorescenza. Questo metodo di colorazione rappresenta un potente strumento per il rilevamento e l’esplorazione di aggregati proteici nelle configurazioni sia clinici che scientifici.
Abstract
Proteine che al deposito dell’amiloide in tessuti in tutto il corpo può essere la causa o la conseguenza di un gran numero di malattie. Tra questi troviamo le malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer e di Parkinson che affligge principalmente il sistema nervoso centrale e amiloidosi sistemica come amiloide nel fegato, carpale dove depositare i amiloide A del siero, transthyretin e catene chiare di IgG tunnel, milza, rene, cuore e altri tessuti periferici. Amiloide è stato conosciuto e studiato per più di un secolo, spesso utilizzando coloranti specifici dell’amiloide come colore rosso di Congo e Tioflavina T (ThT) o Thioflavin (ThS). In questa carta, presentiamo heptamer-formile tiofene acido acetico (hFTAA) come esempio di complementi recentemente sviluppati per questi coloranti chiamati luminescenti oligotiofeni coniugati (LCOs). hFTAA è facile da usare ed è compatibile con la co-macchiatura in immunofluorescenza o con altri markers cellulari. Approfondite ricerche ha dimostrato che hFTAA rileva una vasta gamma di aggregati proteici di malattia associata che convenzionale coloranti dell’amiloide. Inoltre, hFTAA può anche applicarsi per assegnazione ottico di morfotipi distinti aggregati per consentire studi di polimorfismo della fibrilla dell’amiloide. Mentre la metodologia di formazione immagine applicata è facoltativa, abbiamo qui dimostrano l’imaging iperspettrale (HIS), microscopia confocale e durata di fluorescenza (FLIM) di imaging laser. Questi esempi mostrano alcune delle tecniche di imaging dove LCOs possono essere utilizzati come strumenti per acquisire una conoscenza più dettagliata della formazione e proprietà strutturali di amiloidi. Una limitazione importante alla tecnica è, come per tutte le tecniche di microscopia ottica convenzionale, il requisito di dimensioni microscopiche di aggregati per consentire il rilevamento. Inoltre, l’aggregato dovrebbe comprendere una struttura ripetitiva di β-foglio per consentire per l’associazione hFTAA. Eccessiva esposizione di fissazione e/o epitopo che modificano la struttura aggregata o conformazione può render poveri hFTAA associazione e quindi porre limitazioni all’accurato imaging.
Introduction
Deposizione di amiloide nel tessuto è un marchio di garanzia patologico in un numero malattie come il morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson, amiloidosi sistemica e malattie da prioni. Nonostante la prevalenza di malattie amiloide-relativi e il fatto che quasi 40 diverse proteine fino ad oggi sono stati classificati come precursori dell’amiloide in umano1, piccolo è conosciuto circa la relazione tra il deposito dell’amiloide e il fenotipo della malattia. L’istologia dei campioni provenienti da pazienti umani è stato utilizzato sia per scopi diagnostici e scientifici. Un gran numero di modelli animali è stato istituito per studiare la correlazione tra onere dell’amiloide e comportamento, durata e un numero di altri lettura fenotipica outs di malattia progressione2,3. Grandi sforzi si fanno anche nel design per combattere alcuni dei nostri più temute malattie diffuse e scoperta di nuovi farmaci. Tuttavia, la valutazione del legame tra genotipo, fenotipo, carico della placca dell’amiloide e l’amministrazione di droga non è dritto in avanti. Gli strumenti per la colorazione e di imaging di amiloide nel tessuto hanno smussati e forniscono informazioni di bassa risoluzione sulla struttura e sulla formazione dell’amiloide.
Rosso Congo birifrangenza, ThT e ThS fluorescenza sono esempi di metodi classici per la rilevazione e l’analisi degli oneri dell’amiloide nei campioni di tessuto da biopsie di pazienti e post mortem campioni e modelli animali di malattia4. Queste tecniche sono state utilizzate per decenni (colore rosso di Congo dal 1920 e ThT e derivati dal 1960), e anche se la strumentazione è stata perfezionata e permette un’analisi dettagliata, ancora vengono eseguite le procedure di colorazione e analisi allo stesso modo come quasi un secolo fa.
In questo articolo, descriviamo l’utilizzo di un colorante di amiloide romanzo altamente sensibile, hFTAA5, che consente il rilevamento dei depositi di piccola proteina immaturo con alta precisione, come pure la rilevazione di amiloide maturo. Rispetto ai coloranti convenzionali, è stato dimostrato per rilevare una gamma più ampia di malattia associata proteina aggregati5,6,7hFTAA. Inoltre, hFTAA può anche applicarsi per assegnazione ottico di morfotipi aggregati distinti8. Qui, descriviamo la macchiatura di hFTAA e l’analisi del tessuto da affermati modelli animali di malattia da prioni e β-amiloide Precursor Protein (APP) topi transgenici progettata per imitare lo sviluppo della placca nella malattia di Alzheimer9,10 . Mostriamo anche analisi di diagnostica e post mortem campioni da pazienti affetti da amiloidosi sistemica. La LCOs hanno proprietà intrinseche che consente loro di riferire sulle differenze conformazionali all’interno di una placca; e combinando due LCOs con caratteristiche diverse per quanto riguarda l’associazione e fluorescenza, la differenza è ancora più pronunciata11. Un microscopio a epifluorescenza dotato di filtri di passaggio lungo e una testa di macchina fotografica iperspettrale viene utilizzata per consentire la classificazione oggettiva delle proprietà spettrali e la registrazione delle micrografie per analisi spettrale. Microscopia di fluorescenza confocale con un laser sintonizzabile come la sorgente di eccitazione viene utilizzata per valutare le proprietà tridimensionale di una placca amiloide in maggiore dettaglio. Il laser sintonizzabile consente la raccolta di spettro di eccitazione e un passo meno selezione delle lunghezze d’onda di emissione il microscopio permette di co-formazione immagine di fluorescenza LCO e immunofluorescenza per determinare co-localizzazione della proteina dell’obiettivo e dell’amiloide. FLIM offre inedita sensibilità alle differenze conformazionali inflitta la LCOs e rivela differenze che potrebbero non essere rilevate sullo spettro di emissione di fluorescenza.
Gli obiettivi principali con il metodo di colorazione descritto sono di facilitare la rivelazione sensibile di piccoli depositi di amiloide e di caratterizzare polimorfismo conformazionale all’interno di depositi di amiloide. Questa conoscenza è importante per la comprensione di base di malattie di aggregazione di proteine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deposizione di proteine aberrante piegati in amiloide è un evento chiave di molti processi di malattia. Placche di amiloide extracellulare costituito da peptidi Aβ e grovigli neurofibrillari intracellulari formati da tau iperfosforilata sono trovati nel cervello di pazienti con malattia di Alzheimer. Una gamma di differenti proteine, ad esempio, transtiretina (TTR), componente del siero amiloide A (SAA) e misfold catena chiara IgG e manifesto come depositi di amiloide nei tessuti di fuori del sistema nervoso centrale. Anche se mancano di amiloide depositi sono stati conosciuti e studiati per oltre un secolo, abbiamo ancora una conoscenza dettagliata di come amiloide deposizione è avviata a livello molecolare e che cosa può essere fatto per impedire questo processo. Per il morbo di Alzheimer, è necessario confermare come il processo di amyloidosis è associato con il neurodegeneration. Una missione chiave sulla missione per curare amiloidosi è sviluppare romanzo messo a punto strumenti per il monitoraggio dell’amiloide inizio, progressione e regressione; quindi mirata rilevazione dell’amiloide è chiave. Diagnostica clinica potranno a lungo termine, aumentando la sensibilità e la selettività dell’amiloide colorazione metodi7,15. Attuali sfide a questo proposito sono tremendi ed sono un’area di ricerca molto attivo. Un problema principale per lo sviluppo clinico e le prove è diagnosi prognostica. Queste malattie probabile iniziare ben prima che i sintomi compaiono, ma per iniziare con trattamento ci deve essere l’identificazione della malattia. Nel presente documento, la sensibilità è un aspetto fondamentale per nuove metodologie. Inoltre, questo problema è ancora più complesso perché alcuni aggregati proteici sono tossici, alcuni sono protettivi, e alcuni sono neutri. Quindi la possibilità di monitorare specifici aggregati morfotipi è essenziale dal momento che l’esistenza di specie distinte di aggregati è stato suggerito per spiegare il fenotipo eterogeneo segnalato per una varietà di malattie neurodegenerative proteina aggregazione. Per esempio, la proteina prionica è un classico esempio di come una sequenza identica primaria degli aminoacidi possa aggregarsi in distinti morfotipi di aggregazione, che danno luogo a ceppi specifici da prioni. Polimorfismo simile inoltre è stato segnalato per il peptide Aβ, α-synuclein e tau. A questo proposito, LCOs hanno dimostrato di essere strumenti eccezionali per assegnazione ottico di morfotipi aggregati distinti. Proteina prionica-ceppo-specifici aggregati, depositi di proteine trovati in parecchi tipi di amiloidosi sistemica, come pure Aβ polimorfico e aggregati di tau sono stati distinti a causa del fenomeno ottico conformazionalmente indotto osservato dal LCOs.
Deposito dell’amiloide è un evento che si svolge nei tessuti che sono difficili da penetrare con metodi biochimici o biofisici di precisione molecolare. La possibilità di sondare eventi ex vivo, in vivoe in vitro usando le stesse molecole LCO pone le basi per unraveling con eventi che si verificano in vivo usando le tecniche che sono solo possibile applicare su ex vivo o in vitro campioni11,17. Un modello strutturale recentemente segnalati ad alta risoluzione mostra che il pentamerica LCO Alca (pFTAA) lega in una cavità formata da catene laterali paralleli con l’asse della fibrilla che attraversa 6 a registro parallelo beta-fili18, dimostrando che è possibilità di acquisire conoscenze di risoluzione atomica relative alle entità del target LCO. In sostanza la modalità di associazione di cavità e l’associazione di pFTAA è simile a colore rosso di Congo19, dettata da una scanalatura fiancheggiata da ripetitivi positivo carica Lys-catene laterali. L’affinità di LCOs sembrano essere migliore rispetto al rosso Congo probabilmente grazie alla catena di flessibilità e forti interazioni di van der Waals degli atomi dello zolfo degli anelli tiofene verso la cavità idrofobica. La rilevazione di specie prefibrillar (prima risponde ThT)5,20 appare dipenda su fogli β ripetitivo, composti nel registro parallelo-beta-fili, che per hFTAA essere due unità di tiofene più di pFTAA sarebbe intervallo di attraversamento di fino a 8 beta-fili.
Il protocollo di colorazione richiede prestando attenzione alla risoluzione dei problemi presso i seguenti passaggi: (i) fissazione: vasta fissazione dei campioni di tessuto possa alterare la struttura dell’amiloide e limitare la possibilità di rilevare la variazione negli spettri di fluorescenza indotti da distorsione conformazionale della molecola hFTAA. La fissazione mite di cryosections da materiale fresco congelato è preferita per ottenere una ottimale risoluzione spettrale. Tuttavia, hFTAA si macchia e reagiscono in amiloide nel tessuto fisso ma con efficacia ridotta e meno variazione spettrale. (ii) epitopo esposizione: pretrattamento del tessuto per ottenere l’esposizione epitopo per il grippaggio dell’anticorpo occasionalmente potrebbe ridurre la capacità per hFTAA da associare a causa delle perturbato struttura dell’amiloide. Se si tratta di un problema, e l’esposizione di epitopo è un passo cruciale nell’anticorpo che macchia protocollo, utilizzando sezioni consecutive per l’anticorpo e hFTAA, rispettivamente può essere considerato. (iii) overstaining: hFTAA è estremamente sensibile. Soluzioni di lavoro dovrebbero essere tenuti a concentrazione bassa nM. Diminuire la concentrazione di hFTAA se la colorazione di fondo è un problema. Se gli elementi che legano hFTAA sono sparsi nel tessuto, un eccesso di hFTAA può aggregare e si accumulano nel mezzo di montaggio. Questo è riconosciuto come la fluorescenza che non è sul piano di messa a fuoco del tessuto stesso. Se questo appare, immergere il vetrino montato in PBS finché il coprioggetto può essere fatto scorrere della sezione, lavate con PBS e rimontare con mezzo di montaggio fresco e un nuovo slittamento del coperchio. (iv) filtro basato su formazione immagine: questo articolo descrive l’imaging di fluorescenza principalmente spettralmente risolte utilizzando filtri di passaggio lungo o più canali di rilevazione. hFTAA può anche essere controllata utilizzando filtri di passaggio corto. Si prega di essere consapevole che questo ridurrà il contrasto e abolire le possibilità per rilevare i colori multipli.
Negli ultimi anni è diventato evidente che come la ricerca di strumenti, LCOs fluorescente e in particolare hFTAA mostrano proprietà altamente promettente. Risultati sono stati dimostrati per una vasta varietà di proteine e Stati di malattia, che vanno dal rilevamento di hFTAA degli aggregati all’interno delle cellule (tau, miosite), amiloide sistematico di amiloide A del siero, transtiretina, catene chiare dell’immunoglobulina (kappa e lambda) seminogelin 1, prion protein (compresi i campioni clinici)21, polipeptide amiloide dell’isolotto e insulina7,15. Un fattore limitante per l’implementazione di hFTAA come strumento diagnostico è che quello microscopia di fluorescenza non è ampiamente utilizzato nei laboratori di patologia sistematica dell’amiloide. Inoltre, la sua non è prontamente disponibile in clinica. Tuttavia, hFTAA la macchiatura dell’amiloide e microscopia di fluorescenza sono stati utilizzati in laboratori clinici in un microscopio a fluorescenza base filtro e dovrebbeessere considerato come un metodo diagnostico gratuito. Questo è stato recentemente dimostrato sulle biopsie del tunnel carpale con amyloidosis di transthyretin utilizzando le impostazioni di base per fluorescenza in un modo automatizzato22.
Inoltre, oltre a varie proteine, hFTAA fluorescenza riconosce una grande varietà di tipi di fibrille e pre-fibrillari aggregati amiloidi, ad esempio, specie fibrillari via sono stati rilevati e caratterizzati. In questa pubblicazione, abbiamo dimostrato una LCO su vari tipi di campione utilizzando tre tecniche di microscopia. L’utilizzo di sintesi controllata ha permesso anche per lo sviluppo di LCOs per versatile rilevamento di target biomolecolari, ad esempio, registrazione delle interazioni di surface plasmon resonance (SPR)23 e radiolabeling per emissione di positroni di positroni (PET)24.
Ad oggi, sono stati pubblicati oltre 25 diverse LCOs con. Un maggiore uso di LCOs per l’imaging dei giacimenti di amiloide aumenterà la conoscenza e la comprensione di come questi aggregati di malattia-collegati montare, smontare e interferiscano con gli organi e gli individui in cui risiedono.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Mikael Lindgren e Chanan Sluzny per consigli su microscopia di fluorescenza e Adriano Aguzzi, Johan Bijzet, Bouke Hazenberg, Frank Heppner, Mathias Jucker, Therese Klingstedt, Karin Magnusson, Christina Sigurdson, Daniel Sjölander, Christoph Röcken, Gunilla Westermark, Per Westermark e Kurt Zatloukal per contribuire in sezioni di tessuto o micrografie visualizzati in questa pubblicazione. La raccolta dei dati presentati nel presente documento è stata finanziata dai contributi degli svedesi Brain Foundation (Hjärnfonden), l’associazione Alzheimer svedese (Alzheimerfonden), il Consiglio di ricerca svedese (VR), l’associazione Göran Gustafsson, Georg & Astrid Olsson, progetto EU FP7 Health LUPAS e Università di Linköping.
Materials
| hFTAA/Amytracker545 | Ebba Biotech | ||
| Dako fluorescene mounting medium | Agilent technologies | GM304 | |
| LeicaDM6000 | Leica | ||
| Lumen 200 | Prior | ||
| Spectraview system | ASI spectral imaging | ||
| Spectraview software | ASI spectral imaging | ||
| LSM780 | Zeiss | ||
| Zen 2010b v6.0 software | Zeiss | ||
| FLIM system | Becker & Hickl | ||
| Ar/ML 458/488/514 | Zeiss | ||
| Tunable Laser In Tune | Zeiss |
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