Summary

生体内でひと脂肪由来間葉系幹細胞が脂溶性膜の蛍光色素をラット膝関節変形性関節症モデルでの追跡

Published: October 08, 2017
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Summary

このプロトコルでは、効率的に遠赤色蛍光 (IA) の関節内注入によるラット膝変形性関節症 (KOA) モデルで、セルの永続性とひと脂肪由来間葉系幹細胞 (haMSCs) の体内を監視する方法について説明します。

Abstract

膝変形性関節症 (コア)、ひと脂肪由来間葉系幹細胞 (haMSC) 療法の臨床応用を支援するため、セルの永続性の有効性と動物モデルにおける haMSCs の体内を調べた。脂溶性色素と haMSCs の細胞膜にラベルを付ける方法を示しました。その後、心術のコアを持つラットの標識細胞の関節内注入は、生体内イメージング システム動的に監視されました。我々 は、親油性を採用 carbocyanines でした (DilC18 (5))、周囲の組織から自然の緑色蛍光の励起を避けるために赤色レーザーを活用した遠赤色蛍光 Dil (dialkylcarbocyanines) アナログ。またの赤いシフトの発光スペクトルは、生きている動物の深い組織イメージングとラベリングのプロシージャは細胞毒性または haMSCs に機能障害生じなかった許可でした。このアプローチは、KOA ラットモデルにおける haMSCs の効率的な追跡方法であると示されています。最適な投与経路と前臨床試験で他のソースからの MSCs の投与量を決定するこのメソッドのアプリケーションが使えます。

Introduction

膝変形性関節症 (コア) は、関節軟骨の損失や世界の1のまわりの高齢者の主要な慢性疾患になった進歩的な炎症から生じる退行性疾患です。ただし、抗炎症薬、物理的なサプリメントや手術の手順を使用して現在の治療症状痛み2の一時的な救済を提供することがあります。

膝変形性関節症、軟骨の再生と免疫調節特性3、潜在的な多能性分化のための有望な再生治療薬となっているひと脂肪由来間葉系幹細胞 (haMSCs) 4生体内でアクションのメカニズムを調査する薬理学的ルートと比べると、小さなコア動物モデルでライブの haMSCs を追跡する現在の理論的根拠と臨床応用の前に haMSC 療法の有効性を確立するために有益です。前臨床試験の内側半月 (MM) は、一貫性のある再現性5比較的実現可能なモデルを提供するラットでは, コアを誘導するために関節の機械的負荷を不安定化します。MM によるコアの発症は、膝前十字靭帯断裂単独あるいは部分内側半月6より前です。したがって、コアの病理学的微小環境と注入された haMSCs の長期的な相互作用は多くの場合8MM7,投与ラットにおける評価されます。

HaMSCs の薬効は広く報道されると、関連する知識をされているが (IA) の関節内注射による注入 haMSCs の生体内で持続性は乏しい9,10です。したがって、様々 な細胞ラベリング方法が開発されて、immunohistology11、ルシフェラーゼ12、緑の蛍光蛋白質13トランスフェクション、鉄酸化物の磁気共鳴画像 (MRI)14 のラベリングなど、および多数蛍光セル染料8,15,16。手間のかかる組織解析と比較して、生体内の非侵襲的イメージングはリアルタイム配信や蛍光信号10,17の付いた細胞の動態を検出する光学デバイスを採用しています。機能の生きているセルイメージ投射のため cytocompatible の蛍光標識、幹細胞移植18後細胞活動を明らかにする洗練された放射性無料トラッキング手法です。また、多色蛍光脂溶性色素は、アミノ反応親水性染料や蛍光蛋白質が改良されたセル透磁率および増強蛍光量子収量19を含む上の利点を所有しています。

こうして、ここで含まれるプロトコル利用赤い脂溶性 carbocyanines ラベルの付いたセルを励起するレーザーでした (DilC18(5))、遠赤色蛍光 Dil (dialkylcarbocyanines) アナログ20であります。赤いシフト励起と発光スペクトルされる干渉を回避したし、深い組織の生きている動物の8時間の長期間画像をことができます。この方法で追跡細胞の生体内での付いたでしたを理解し、現在の幹細胞再生治療の向上に不可欠な動物モデルでの haMSCs などの移植の幹細胞を監視するためです。

Protocol

動物を対象とする手順は動物の苦痛を最小限に抑える努力をローカル機関動物のケアと倫理委員会で承認されました。次のプロトコルは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) 上海 9 人によって承認された ’ プロトコルと上海交通大学医学部付属病院 s [2017] 番号 063。 1 です Surgically-Induced ラット膝関節変形性関節症モデルの確立 この手術、250 と 300 g. 間体重?…

Representative Results

コア モデルを誘導するために MM は SD ラット (図 3) の右ひざ関節で行われました。手術後 8 週間ラットを犠牲に、膝継手の連続切片を両方 H で行った & E、サフラニン O/高速グリーン染色 (図 4)。H の & E 染色、関節軟骨の表面の展示手術膝手術をせず通常の関節よりも粗いボーダー。サフラニン-O/高速緑染色 (赤染色) …

Discussion

我々 はベンチから枕元にコアの再生幹細胞治療をもたらすことができる前に、安全基準と体内の幹細胞療法の研究は必要緊急です。ただし、疾患の病理組織学的環境は、永続性と移植 haMSCs10の体内で重要な役割を果たしています。最近、私たちのグループを示した haMSCs の関節内注入の永続化をもはや病理コア環境よりも通常の条件8下注射をしました。炎…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

現在の研究は、上海科学技術委員会の上海の自治体 (CN) 博士温王に主催の革新資金 (294300 1402 H) によって支えられました。彼の技術支援とこの原稿の科学的助言のため広東省周博士 (組織工学センターの中国国家) に感謝したいと思います。我々 も感謝したい氏 Huitang 夏 (上海第九人民病院) 動物の福祉に貢献しました。

Materials

Matrx VMR animal anesthesia system Midmark VIP3000
4-0 suture Shanghai Jinhuan KC439
Razor Pritech LD-9987
Gentamicin Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd. None
0.9% Sodium chloride solution Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd. H43020455
Penicillin Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd. None
Buprenorphine Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd. None
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 16005 Dilute to final concentration of 10% in PBS
EDTA Sigma-Aldrich E9884 Dilute to final concentration of 20% in PBS
0.1% Hematoxylin Solution, Mayer’s Sigma-Aldrich MHS16
0.5% Eosin Y solution, alcoholic Sigma-Aldrich HT110116
Safranin O Sigma-Aldrich S8884
Fast Green Sigma-Aldrich F7258
Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor Thermo Fisher A78400006
Shandon Histocentre™ 3 Tissue Embedding Center Thermo Fisher B64100010
Fully Automated Rotary Microtome Leica RM2255
DiD Molecular Probes, Life
Technologies
V-22887
D-MEM High Glucose Sigma-Aldrich D5648
PBS GIBCO, Life Technologies 14190-144
0.25% Trypsin-EDTA Invitrogen 25200-114
10 cm Petri Dish Corning V118877
Centrifuge Beckman Optima MAX-TL
Fluorescent microscope Olympus BX53
0.4% Trypan Blue solution Sigma-Aldrich 93595
Titetamme Virbac (Zoletil 50) 1000000188
Zolazepam Virbac (Zoletil 50) 1000000188
Sterile hyposermic syringe for single use 26G Shanghai Misawa Medical Industry None
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System PerkinElmer 124262
Living Imaging 4.0 software PerkinElmer None

References

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Li, M., Hao, M., Jiang, D., Chen, Y., Wang, W. In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye. J. Vis. Exp. (128), e56273, doi:10.3791/56273 (2017).

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