이 프로토콜에는 빨강 형광 라벨 내부 관절 (IA) 주입을 통해 쥐 무릎 관절염 (KOA) 모델에 의해 셀 속성과 biodistribution 인간 지방 유래 중간 엽 줄기 세포 (haMSCs)의 모니터링 하는 효율적인 방법을 설명 합니다.
무릎 관절염 (KOA)에 대 한 인간 지방 유래 간 엽 줄기 세포 (haMSC) 치료의 임상 적용을 지원 하기 위해 셀 지의 효능과 동물 모델에서 haMSCs의 biodistribution을 검사 합니다. 우리는 질 성 형광 염료와 haMSCs의 세포 막에 레이블을 하는 방법을 설명 했다. 그 후, 수술로 유도 KOA와 쥐에 있는 레이블된 셀의 내부 관절 주사는 vivo에서 이미징 시스템에서 동적으로 모니터링 했다. 우리는 질 성 고용 carbocyanines 않았다 (DilC18 (5)), 조직 주변에서 자연 녹색 autofluorescence의 자극을 피하기 위해 빨간색 레이저를 활용 하는 빨강 형광 Dil (dialkylcarbocyanines) 아날로그. 또한, 레드 이동 방출 스펙트럼의 살아있는 동물에서 깊은 조직의 이미징 및 레이블 프로시저 발생 세포 독성 효과 또는 haMSCs 기능 손상을 허용 했다. 이 접근은 쥐 KOA 모델에서 haMSCs에 대 한 효율적인 추적 방법으로 보였다. 이 방법의 응용 프로그램 또한 최적의 관리 경로 및 전 임상 연구에서 다른 소스에서 MSCs의 복용량을 결정 하기 위해 사용 될 수 있습니다.
무릎 관절염 (KOA) 관절 연골 손실 및 진보적인 염증, 되 고 있다는 세계1주위 노인에서 주요 만성 질환 인 퇴행 성 질환 이다. 그러나, 항 염증 제 약물, 물리 보충, 및 수술 절차를 사용 하 여 현재 치료만 증상 통증2에 대 한 임시 구호를 제공할 수 있습니다.
무릎 관절염, 연골 재생, immunomodulatory 속성3, 잠재적인 multipotent 그들의 차별화 때문에 유망한 재생 치료 되 고 인간 지방 유래 중간 엽 줄기 세포 (haMSCs) 4. 약리학 노선 vivo에서행동의 메커니즘을 조사와 비교 하면, 현재 유익에 대 한 근거 및 임상 응용 프로그램 이전 haMSC 치료의 타당성을 확립 하는 작은 KOA 동물 모델에서 라이브 haMSCs를 추적. 전 임상 시험에 대 한 중간 meniscectomy (MM) destabilizes 일관 재현성5상대적으로 가능한 모델을 제공 합니다 쥐, KOA를 유도 하 관절의 기계적 부하. KOA m M에 의해 유도 된의 발병은 전방 십자 인 대 transection 혼자 또는 결합 부분 중간 meniscectomy6보다 이전. 따라서, KOA의 병 적인 microenvironment로 주입 된 haMSCs 간의 장기 상호 작용 종종 m M7,8에 의해 유도 된 쥐에 평가 됩니다.
비록 haMSCs의 치료 효능에 광범위 하 게 보고, 관련 지식이 하고있다 내 관절 (IA) 주입을 통해 이식된 haMSCs의 비보에 지 속성 부족9,10입니다. 따라서, 다양 한 세포 표시 방법은 개발 되었다, immunohistology11, luciferase12, 녹색 형광 단백질13 transfection, 자기 공명 영상 (MRI)14에 대 한 라벨 산화 철을 포함 하 여 , 그리고 수많은 형광 셀 염료8,,1516. 노동 집약적인 조직학 분석 비교, vivo에서 비 침략 적 영상 실시간 유통 및 형광 신호10,17으로 표시 하는 셀의 역학을 감지 하는 광학 장치를 사용 합니다. 기능 라이브 셀 이미징에 대 한 cytocompatible 형광 라벨 줄기 세포 이식18후 세포 활동을 공개 하는 정교한 무료 방사성 추적 기술입니다. 또한, 다 색 형광 닥터지 염료 친수성 아미노산 반응성 염료 나 형광 단백질, 그들의 향상 된 세포 침투성 등 향상 된 형광 양자 수율19이점을 있습니다.
따라서, 여기에 포함 된 프로토콜 활용 빨간색 레이저 질 성 carbocyanines로 표시 하는 세포를 자극 했다 (DilC18(5)), 빨강 형광 Dil (dialkylcarbocyanines) 아날로그20입니다. 빨간색 이동 여기 및 방출 스펙트럼 autofluorescent 간섭 방지 않았다 하 고 깊은 조직 동물8시간의 긴 기간 동안 이미징 있습니다. 추적의이 방법은 세포 vivo에서 표시 한은 이해 하 고 현재 줄기 세포 재생 치료 개선에 필수적인 동물 모델에서 haMSCs 같은 이식된 줄기 세포 모니터링에 적합.
우리는 머리 맡에 벤치에서 코 아에 대 한 재생 줄기 세포 치료를 가져올 수 있는 전에 안전 표준 및 줄기 세포 치료의 biodistribution 연구 절실히 필요는 합니다. 그러나, 질병의 병 적인 환경 지 속성에 biodistribution 이식된 haMSCs10의 중요 한 역할을 재생합니다. 최근, 우리의 그룹 보다 정상적인 조건을8에서 주사 병 적인 KOA 환경 haMSCs의 내부 관절 주사 이상 유지는…
The authors have nothing to disclose.
현재 연구는 상하이 혁신 자금 (1402 H 294300) 과학 및 기술 위원회의 상하이 시 (CN) 박사 원 왕 후원에 의해 지원 되었다. 우리는 그의 기술 지원 및이 원고에 대 한 과학적 조언에 대 한 광 저 우 박사 (조직 공학 센터의 중국 국가)를 감사 하 고 싶습니다. 우리 또한 싶습니다 씨 Huitang 쌰 (상해 9 사람들의 병원) 감사 하 고 동물 복지에 그의 도움에 대 한.
Matrx VMR animal anesthesia system | Midmark | VIP3000 | |
4-0 suture | Shanghai Jinhuan | KC439 | |
Razor | Pritech | LD-9987 | |
Gentamicin | Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd. | None | |
0.9% Sodium chloride solution | Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd. | H43020455 | |
Penicillin | Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
Buprenorphine | Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Dilute to final concentration of 10% in PBS |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Dilute to final concentration of 20% in PBS |
0.1% Hematoxylin Solution, Mayer’s | Sigma-Aldrich | MHS16 | |
0.5% Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110116 | |
Safranin O | Sigma-Aldrich | S8884 | |
Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor | Thermo Fisher | A78400006 | |
Shandon Histocentre™ 3 Tissue Embedding Center | Thermo Fisher | B64100010 | |
Fully Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
DiD | Molecular Probes, Life Technologies |
V-22887 | |
D-MEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
PBS | GIBCO, Life Technologies | 14190-144 | |
0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-114 | |
10 cm Petri Dish | Corning | V118877 | |
Centrifuge | Beckman | Optima MAX-TL | |
Fluorescent microscope | Olympus | BX53 | |
0.4% Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | 93595 | |
Titetamme | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
Zolazepam | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
Sterile hyposermic syringe for single use 26G | Shanghai Misawa Medical Industry | None | |
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
Living Imaging 4.0 software | PerkinElmer | None |