Перерезка частичное зрительного нерва у крыс: модель с новой постановляющей части подход к оценке вторичной дегенерации сетчатки ганглия клеток
Summary
Вторичной дегенерации сетчатки ганглия клеток (РГК) обычно возникает в глаукомы. Это исследование описывает постановляющей части новаторский подход для частичного зрительного нерва перерезка. Использование этой экономии пространства оперативного подхода расширяет диапазон применения модели и позволяет исследовать вторичного повреждения механизмов в РГК в новый путь.
Abstract
Предыдущие исследования показали, что вторичной дегенерации сетчатки ганглия клеток (РГК) обычно возникает в глаукомы. Перерезка частичное зрительного нерва считается полезным и воспроизводимые модели. По сравнению с другими моделями повреждения зрительного нерва, обычно используется для оценки вторичной дегенерации, например полный зрительный нерв перерезка и зрительного нерва раздавить модели, модель частичной зрительного нерва перерезка превосходит как оно отличает первичной от вторичной дегенерации в situ. Таким образом он служит прекрасным инструментом для оценки вторичной дегенерации. Это исследование описывает Роман оперативного подхода перерезка частичной зрительного нерва, непосредственно обратившись к области ретробульбарная зрительного нерва через боковые стенки глазницы глазного яблока. Кроме того мы представляем новый дизайн, низкая стоимость хирургический инструмент для оказания помощи с перерезка. Как свидетельствует представитель результаты в разграничении границы областей первичных и вторичных повреждений, новый подход и инструмент обеспечивает высокую эффективность и стабильность модели, предоставляя достаточное пространство для хирургической операции. Это в свою очередь делает его легко отделить от зрительного нерва до перерезка менингеальные оболочкой и глазных сосудов. Дополнительным преимуществом является, что этот компактный постановляющей части подход улучшает способность следователей применять препараты, перевозчиков или селективного RGC Трейсеры пень частично пересекал зрительного нерва, позволяя изучение механизмов за вторичные травмы в РГК, новым способом.
Introduction
Вторичной дегенерации происходит обычно в центральной нервной системе (ЦНС) после травм и следующие острые и хронические нейродегенеративные заболевания. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 смерть нейронов и глиальных клеток как следствие раннего первичного патологического событий называется первичной дегенерации, в то время как вторичной дегенерации относится к гибели нейронов и глиальных клеток, которые являются не только частично или пострадавших от начальной повреждения. Считается также, что вторичной дегенерации РГК происходят в глаукомы. 6 Yoles и др. 7 подтвердил, что вторичные травмы РГК происходит в модель повреждения зрительного нерва. Они показали, что нейроны, аксоны которых не были ранены после острого повреждения выродится в конечном итоге из-за дегенеративных условий производства травмы, окружающих эти аксоны. Этот вторичной дегенерации влияет нейронов в прогрессивной моды, относящиеся к тяжести повреждения. До настоящего времени лежащие в основе RGC повреждения при глаукоме механизмы остаются неясными, особенно тех, которые касаются вторичные травмы, которая приводит к недостаточной клинического лечения. 8 , 9 , 10 таким образом, это необходимо для изучения основных механизмов вторичной дегенерации РГК в ходе развития глаукомы. 11 создание животных моделей вторичных повреждений, которые могут количественно оценить размер, распределения и механизм вторичной дегенерации РГК привлекает все большее внимание ученых, изучающих вторичные травмы РГК.
Чтобы прояснить этот вопрос, модель PONT крыса была учреждена Levkovitch-Вербин и др. 12 для оценки аксональное травмы индуцированной дегенерация и смерть РГК. Считается, что эта модель является хорошим инструментом для изучения механизмов вторичной дегенерации и выявления потенциальных агентов нейропротекторной. Инструмент, используемый для создания этой модели вторичных повреждений является Алмазный нож со шкалой к створу количественно, установив глубина осыпания через ручку dial, чтобы завершить количественных перерезка зрительного нерва. Хирургический путь подходов от височной или вверх конъюнктивы глазного яблока. Во время процесса постановляющей части сетчатки и зрительных нервов могут быть затронуты силы щипцы, который в свою очередь может привести к первичной травмы. Что еще более важно из-за ограниченного пространства подвергаются зрительного нерва, трудно отделить менингеальные платье до разреза. Таким образом можно повредить офтальмологический судов во время перерезка частичной зрительного нерва, что приводит к сетчатки ишемии и провал модели. Кроме того Алмазный нож является дорогостоящим, и каждое использование уменьшает резкость наконечник. Это в свою очередь может повлиять на глубину и силу моделирования.
Модель вторичной дегенерации РГК, описанные в данном исследовании был получен через нового оперативного подхода от боковой стенки глазницы глазного яблока. Этот роман оперативного подхода напрямую обращается к ретробульбарная зрительного нерва, окруженных орбитальной мышцы конуса, избегая первичной травмы глазного яблока и зрительного нерва, когда потянув вниз или в сторону носа боковой глазного яблока. Это также увеличивает пространство хирургической операции во время создания модели и позволяет менингеальные оболочки изоляции перед частично transecting зрительного нерва. Важно заметить, что случайного участия и травмы глазной сосудов может привести к провалу модели. Кроме того модель позволяет последующей оценки transfected клеток, препаратов и реагентов на пне частично пересекал зрительного нерва. Самостоятельно разработанные хирургический инструмент дешево и можно использовать несколько раз, тем самым снижая стоимость моделирования. Вторичные травмы модель РГК, установленных этим методом было показано иметь хорошую воспроизводимость и стабильности.
Protocol
Representative Results
Discussion
Оперативные процедуры
Есть некоторые моменты достойное уведомления в процессе построения модели. В шаге 4.2 хирургические движения должны выполняться тщательно, чтобы избежать повреждения сосудистую выше субфасциальная мышцы. Особенно при резке подкожной фасции в наружной бокового угла глазной щели, острые зубчатые щипцами должны использоваться для тянуть вверх подкожной фасции на поверхности фасции вертикально; фасции следует сократить с беззаботными весной ножницы, чтобы избежать повреждения орбитальных вен в внешнего угла глазной щели, которая может привести к недостаточности модель чрезмерное кровотечение. Шаг 4.3 имеет преимущество потенциально предотвращения кровотечения при удалении непосредственно из кровеносных сосудов. В разделяющей орбитальной мышцы в шаг 4.5, причина для комплектации острые зубчатые пинцет, но не беззаботными весной ножницы, чтобы избежать непрерывной кровотечения и кровоизлияния. Тупо мышцы отделяются с обеих сторон в перпендикулярном направлении фасции разрез кожи; Тем временем глубоких мышц орбиты растягивается наружу и периферии. Эта процедура позволит выявить глубокие части орбитальной полости, обеспечивая окно больших хирургических и беспрепятственного доступа к ткани, наложение зрительного нерва. В вышеуказанных процедур, если кровотечение происходит, давление должно применяться с использованием стерильных хирургического или ватные тампоны. Незначительные кровотечение остановится через несколько секунд после этой процедуры. Шаг 4.6 предназначен для облегчения последующей операции легко удалить некоторые жира и отдельных мышц в конус мышц орбиты подвергать зрительного нерва вдоль направления зрительного нерва в орбитальной глубины.
Наиболее важные части текущего протокола являются шаги 5.1-5.6. Важно, чтобы не повредить сосудистую вокруг головы зрительного нерва. Зрительного нерва должны быть частично перерезанных гори по крайней мере 1.5-2.0 мм от задней части глаза, чтобы избежать повреждения глазной артерии, которая проникает нерва в пределах 1 мм глаза и поставляет кровь к внутренней сетчатки. Резка боковые прямая предназначен для достижения лучшего воздействия зрительного нерва, как боковые прямая широк и явно блокирует мнение зрительного нерва. Между тем чтобы избежать удаления глазной артерии, который связан с менингеальные оболочки (рис. 5), это необходимо отделить и разъединять Дура вокруг зрительного нерва и изучения сосудистого рисунка менингеальные оплетке, с помощью щипцами осторожно поверните оболочка. Кроме того должны быть определены области лишена кровеносных сосудов, позволяя продольной резки в оболочке менингеальные. Это также необходимо сохранить небольшое рабочее расстояние от задней части глаза, чтобы избежать часть Дура, которая тесно связана с глазной артерии. Сетчатки обычно прозрачен, и кровеносных сосудов может быть четко демаркированы. В случае повреждения сетчатки кровоснабжение сетчатки является выродились, ведущих к молочно белый хлопьевидный внешний вид. Стекловидного глаз и объектив будет, как правило, становятся ясно также, снижение глаз размер с течением времени. В этом исследовании предоперационное и послеоперационное изображений глазного дна подтвердил без ущерба для глазного дна кровоснабжение в модели после применения выше шаги.
Кроме того в несколько шагов этой модели требуется особый уход. При использовании Шарп изогнутые зубчатые щипцами или других хирургических инструментов подвергать зрительного нерва, хирург следует избегать чрезмерной силы, как это может привести к повреждению зрительного нерва, глазного яблока или глазной артерии, приводит к первичной травмы и сетчатки ишемии. Кроме того кровеносных сосудов вокруг глаз не должны быть повреждены, чтобы избежать постоянной кровотечение, которое может привести к провалу моделирования. SSAI, используемые в этом эксперименте требует деликатного использования. Когда зрительный нерв располагается внутри инструмент groove, зрительного нерва и рифленой поверхности должны быть плотно установлены для обеспечения хорошей консистенции и повторяемость каждой модели на животных. С практикой полный хирургическая процедура может быть выполнена в течение 15-20 минут в глаз, после первоначального въезда порезы были сделаны.
Wang et al. 19 опубликовал аналогичные животных модель частичной зрительного нерва перерезка с помощью количественных amputator зрительного нерва. Хирургических процедур включает в себя: 1) резка отдельно от внешнего угла глазной щели, приостановления и фиксации глазной Улучшенный; 2) изучения зрительного нерва и transecting Улучшенный часть зрительного нерва с использованием amputator; и 3) ушивание конъюнктивы и кожи. Хотя хирургическая процедура была относительно простой, во время операции были обнаружены следующие проблемы. Хотя бокового угла глазной щели разрез может предоставить определенное пространство для работы, была неизбежной необходимость постоянно растянуть глазного яблока, чтобы разоблачить ретробульбарная оболочка зрительного нерва, особенно когда хирурги подвергать более ретробульбарная зрительного нерва оболочка для облегчения дальнейшей изоляции оболочки; силу для растяжения глазного яблока было больше, что может вызвать травмы прямой тяги глазного яблока и зрительного нерва. Не особое внимание было уделено кровеносных сосудов, которые могут быть сокращены вместе с оболочкой зрительного нерва, и повреждение кровеносных сосудов может привести к неудачной модель создания. Основные процедуры вторичного повреждения модели, описанные в этом документе являются: новый оперативный подход от боковой стенки глазницы глазного яблока прямого доступа ретробульбарная зрительного нерва, окруженный орбитальной мышцы конуса, избегая первичный ущерб глазного яблока и зрительного нерва, когда потянув вниз или в сторону носа боковой глазного яблока. Этот новый подход оперативного увеличивает пространство хирургической операции во время моделирования и позволяет легко изоляции менингеальные оболочки, который тесно связан с глазной артерии, до частичной перерезка зрительного нерва. Перерезка частичное зрительного нерва была выполнена с собственной разработки хирургический инструмент, который является экономически эффективным и многоразовые, уменьшая общую стоимость моделирования. Крыса орбитальной структуры отличаются от других млекопитающих, с орбиты ближе к угла глазной щели и не костные структуры, но покрыты мышц. Хирургический подход может достичь задней части глазного яблока без необходимости уничтожать орбитальной кости и надкостницы. Через строгий дезинфекции предоперационное и послеоперационное Антибиотикопрофилактика были значительно сокращены инфекции, воспаления и отеки.
Самостоятельно разработанные помощник Инструмент хирургический
Крысы модель частичной зрительного нерва перерезка был создан, используя инструмент самостоятельно разработанные хирургические помощником, чьи основные функции заключаются в следующем. Она может помочь в частичной количественных перерезка зрительного нерва, подвергаются к краю рифленая, также обеспечение согласованности перерезка среди различных животных. Мы протестировали и проверены повторяемость создание модели с SSAI. Максимальный коэффициент вариации был 1,85%, а среднее значение 0,67% ±0. 44%. 20 эти результаты показывают, что SSAI могут использоваться для установления частичное зрительного нерва перерезка модели, с удовлетворительным воспроизводимость и ООНiformity.
Рифленая поверхность ширина и дизайн полукруг паз внутренней поверхности могут иметь более фиксированными на зрительный нерв и сделать рифленая поверхность и зрительного нерва придают более плотно, также снижается экспериментальной ошибки и побочных реакций. Рифленые края позволяет лучшую защиту зрительного нерва в паз во время операции, которая не приведет к повреждению зрительного нерва в паз, независимо от того, резак резкость. Еще одним преимуществом рифленые края является раздавить травматизма во время перерезка зрительного нерва.
Это подходит для эксплуатации в глубоких и узких пространства. Хотя новый подход постановляющей части была расширена, путь остается глубоким, и совместная секция и ручные полюс может использоваться для место желобчатых голову легко под оболочкой зрительного нерва для выполнения последующих операций. Когда инструмент используется для операции, широкий спектр фрезы могут использоваться для перерезка, например кончик иглы 26 G. Даже нож Сапфир хирургические зонд можно выбрать для избежания ушиба и раздавить травм, вызванных ножницы. Паз поверхности может производиться в различных вертикальных глубин для выполнения различной степени зрительного нерва резки.
По сравнению с amputator Wang et al. SSAI имеет простой структуры. Кроме того резки шаг является более удобным, с использованием SSAI, с улучшенной консистентности и повторяемость животной модели. Наконец ряд инструментов для резки с SSAI также шире. В заключение SSAI, которая делает количественные и единообразных разрезов нерва, может служить эффективным инструментом для создания крыса модели для оценки перерезка зрительного нерва.
Характеристики модели перерезка крысы частично зрительного нерва
Перерезка модель частичной зрительного нерва является полезным оценить вторичной дегенерации в РГК. Потенциальные преимущества этой модели является возможность отделить основной от вторичной дегенерации точно на месте, как в сетчатки и зрительного нерва. Центральный и брюшной зрительных нервов были более восприимчивы к вторичные травмы после частичной перерезка (около 1/3 до 1/2) спинной зрительного нерва (рис. 6). В сетчатке региональные расположение первичных и вторичных повреждений РГК должны основываться на топографии зрительного нерва, соответствующий сетчатки РГК после частичной перерезка. Если весь сетчатки крыс разделен спинной (superior) и брюшной (нижней) части, вторичных и первичных повреждений присутствуют в обеих частях. Однако основываясь на отношения между РГК на сетчатки и зрительного нерва Аксон, RGC смерти в вентральной сетчатки должны главным образом объяснить вторичных повреждений (рис. 3). 12 , 22 , 23 преимущества этой модели включают: простой и простой в эксплуатации инструмент с стандартными процедурами; не влияет на офтальмологические судов; хорошая воспроизводимость и стабильности. Этот метод может использоваться для transfect РГК от этой экономии пространства оперативного подхода путем применения короткие интерферирующие РНК (малые интерферирующие РНК), плазмиды, а пень вирусных векторов для частичного зрительного нерва; Кроме того реагентов может располагаться на пне частичного зрительного нерва для селективного обращения или маркировки РГК.
Общее, начальное и среднее травм РГК сосуществовали после частичной зрительного нерва перерезка в этой модели на животных, с четкой границей в сетчатке между типами две травмы. Хотя Ассоциация аксоны зрительного нерва и Королевское расположение на сетчатке необходимо дальнейшее расследование для более точного разграничения, этот компактный постановляющей части подход расширяет диапазон применения модели и позволяет исследователям изучить механизмы вторичного повреждения в РГК в новый путь.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Фондом Пекин естественных наук (7152038), фундаментальные исследования средств для университетов Центральной Центральной Южного университета (2016zzts162) и науки исследовательский фонд Aier глаз больницы группы (Грант № AF156D11). Наконец Янь Fancheng спасибо ЙиПинг Сюй за бесценную поддержку, с годами.
Materials
| Animal Aneathesia Ventilator System | MIDMARK | Matrx VMR | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co. | R510-22 | |
| Surgical Microscope | Leica AG, Heerbrugg, Switzerland | M620 F20 | |
| Tobramycin Eye ointment | Alcon | H20110312 | |
| Fluorogold | Biotium | 80014 | |
| Iris scissors | 66vision Co. | 54026 | |
| Vannas spring scissor | 66vision Co. | 54137B | |
| Sharp-serrated forceps/0.12mm toothed forceps | 66vision Co. | 53329A | |
| Sharp-curved forceps | 66vision Co. | 53324A | |
| Sapphire surgical probe | 66vision Co. | 50205TA | |
| 26G needle tip | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co. | 3151474 | |
| 10 μl Hamilton Syringe | Hamilton Co. | 80030 | |
| 5-0 non-absorbable suture | Johnson & Johnson International Co. | W580 | |
| Chlorhexidine | Sigma-Aldrich | 282227 | |
| Stereotaxie apparatus | RWD Life Science Co. | 68026 | |
| Retinal Imaging System | OptoProbe Ltd. | OPTO-RIS | |
| RetCamII wide field imaging system | Clarity Medical Systems,Inc. | RetCamII | |
| Fluorescence microscope | Leica Microsystems Inc. | DM6000 |
References
- Stoica, B. A., Faden, A. I. Cell death mechanisms and modulation in traumatic brain injury. Neurotherapeutics. 7 (1), 3-12 (2010).
- Hausmann, O. N. Post-traumatic inflammation following spinal cord injury. Spinal Cord. 41 (7), 369-378 (2003).
- Oyinbo, C. A. Secondary injury mechanisms in traumatic spinal cord injury: a nugget of this multiply cascade. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (2), 281-299 (2011).
- Guimaraes, J. S., et al. Mechanisms of secondary degeneration in the central nervous system during acute neural disorders and white matter damage. Rev Neurol. 48 (6), 304-310 (2009).
- Stewart, S. S., Appel, S. H. Trophic factors in neurologic disease. Annu Rev Med. 39, 193-201 (1988).
- Brubaker, R. F. Delayed functional loss in glaucoma. LII Edward Jackson Memorial Lecture. Am J Ophthalmol. 121 (5), 473-483 (1996).
- Yoles, E., Schwartz, M. Degeneration of spared axons following partial white matter lesion: implications for optic nerve neuropathies. Exp Neurol. 153 (1), 1-7 (1998).
- Nickells, R. W. From ocular hypertension to ganglion cell death: a theoretical sequence of events leading to glaucoma. Can J Ophthalmol. 42 (2), 278-287 (2007).
- Doucette, L. P., Rasnitsyn, A., Seifi, M., Walter, M. A. The interactions of genes, age, and environment in glaucoma pathogenesis. Surv Ophthalmol. 60 (4), 310-326 (2015).
- Osborne, N. N., Melena, J., Chidlow, G., Wood, J. P. A hypothesis to explain ganglion cell death caused by vascular insults at the optic nerve head: possible implication for the treatment of glaucoma. Br J Ophthalmol. 85 (10), 1252-1259 (2001).
- Rokicki, W., Dorecka, M., Romaniuk, W. Retinal ganglion cells death in glaucoma–mechanism and potential treatment. Part II. Klin Oczna. 109 (7-9), 353-355 (2007).
- Levkovitch-Verbin, H., et al. A model to study differences between primary and secondary degeneration of retinal ganglion cells in rats by partial optic nerve transection. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (8), 3388-3393 (2003).
- Magharious, M. M., D’Onofrio, P. M., Koeberle, P. D. Optic nerve transection: a model of adult neuron apoptosis in the central nervous system. J Vis Exp. (51), (2011).
- Yoles, E., et al. GM1 reduces injury-induced metabolic deficits and degeneration in the rat optic nerve. Invest Ophthalmol Vis Sci. 33 (13), 3586-3591 (1992).
- Fisher, J., et al. Vaccination for neuroprotection in the mouse optic nerve: implications for optic neuropathies. J Neurosci. 21 (1), 136-142 (2001).
- Levkovitch-Verbin, H., et al. RGC death in mice after optic nerve crush injury: oxidative stress and neuroprotection. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (13), 4169-4174 (2000).
- Li, Y., et al. VEGF-B inhibits apoptosis via VEGFR-1-mediated suppression of the expression of BH3-only protein genes in mice and rats. J Clin Invest. 118 (3), 913-923 (2008).
- Tang, Z., et al. Survival effect of PDGF-CC rescues neurons from apoptosis in both brain and retina by regulating GSK3beta phosphorylation. J Exp Med. 207 (4), 867-880 (2010).
- Wang, X., Li, Y., He, Y., Liang, H. S., Liu, E. Z. A novel animal model of partial optic nerve transection established using an optic nerve quantitative amputator. PLoS One. 7 (9), e44360 (2012).
- Yan, F. C., Li, S. N., Liu, K. G., Lu, Q. J., Wang, N. L. The establishment of a rat partial optic nerve transection model and assessment of its reproducibility. Ophthalmology in China. 22 (1), 34-37 (2013).
- Fitzgerald, M., et al. Secondary degeneration of the optic nerve following partial transection: the benefits of lomerizine. Exp Neurol. 216 (1), 219-230 (2009).
- Fitzgerald, M., et al. Near infrared light reduces oxidative stress and preserves function in CNS tissue vulnerable to secondary degeneration following partial transection of the optic nerve. J Neurotrauma. 27 (11), 2107-2119 (2010).
- Li, H., et al. Lycium barbarum (wolfberry) reduces secondary degeneration and oxidative stress, and inhibits JNK pathway in retina after partial optic nerve transection. PLoS One. 8 (7), 68881 (2013).
