诱导麻痹及视觉系统损伤小鼠 T 细胞特异的视神经脊髓炎抗原水通道蛋白-4

所有动物手术均符合由加利福尼亚大学、 旧金山体制动物护理和使用委员会核准的试验准则。C57BL/6 (H-2 b) 雌性小鼠，8 周大的时候，被购买和 C57BL/6 AQP4 -/- 小鼠由 A.Verkman. 1.免疫的小鼠与 AQP4 肽 准备完全弗 ' s 佐剂 (CFA) 工作股票。 细磨干燥的制备的 结核分枝杆菌 (H37Ra) 用研钵和杵。 添加地面对不完全佐剂 H37Ra ' s 佐剂对终浓度为 4 毫克/毫升。终审法院可以存储在 4 ° C，长达 6 个月。 溶解冻抗原 (Ag) AQP4 肽在磷酸盐缓冲液 (PBS) 至终浓度为 1 毫克/毫升。保持在 4 ° C 或在冰面上 准备大会 2 针头锁注射器，与旋塞阀，加入含终审法院/多肽乳液。 附加不到 2 个男性 luer-锁连接的 3 种方式尼龙旋塞阀柱塞的玻璃针头锁注射器。通过切换对注射器杠杆关闭旋塞阀。注射器，允许注射器作为测试管的开口端的位置。放在管架，增加稳定性。 涡终审法院工作股票和 Ag 解决方案。加 1:1 体积的肽 / 打开注射器的终审法院。200 µ L 的终审法院/Ag (4 x 50 µ L) 每个都需要鼠标。 注意： 通常情况下，大约 1 毫升的制备是迷失在旋塞阀，这将减少可用免疫的金额。因此，它是重要的是融入到所需的总体积的计算. 示例： 为 5 小鼠免疫: （200 微升/动物 x 5 动物） + 1 毫升额外容量 = 总终审法院/Ag 所需的 2 毫升。 插入玻璃柱塞进入注射器和同时举行的地方，以便旋塞阀是面向向上反转注射器。切换到未使用的螺纹连接旋塞阀杠杆。仔细按压玻璃柱塞以从注射器中删除多余的空气。液体填充第二个男性 luer-锁连接旋塞阀。 旋塞阀的第二个男性 luer-锁连接到附加第二玻璃注射器 （柱塞完全插入）。这应该是一个封闭的系统 2 玻璃注射器与包含作为尽可能小过量空气旋塞阀连接。 创建的乳液，混合推动柱塞传给液体交替之间大约 2 分钟寒意在大约 10 分钟冰上的注射器重复 2 注射器令人不寒而栗的和搅拌直至有明显是改变了粘度的制备导致非常僵硬，白色的乳液。冷藏的注射器包含在 4 ° C 的乳胶或维持在冰面上 将所有的乳状液转移到一个玻璃注射器针头锁、 删除空的玻璃注射器和替换 1 毫升注射针头注射器。用乳液填充新的注射器、 删除从旋塞阀和附加一根针 (25 x 5/8)。 " 水测试 " 乳液的一致性。一个小碟子里面的水驱逐一滴乳液性能的影响。乳液应该不能分散，指示它适合于注射。 乳液分散，如果它不是准备注射; 转移液体回玻璃注射器并继续混合，然后再放松，直到乳液是僵硬。 再次测试乳液，直到取得了适当的浓度。 注入捐助 AQP4 -/- 小鼠皮下注射 （南卡罗来纳州） 与含 AQP4 肽乳液。每个鼠标接收 4 x 50 µ L s.c.注射 (200 µ L 总 （100 微克肽）)。4 网站包括双方的下腹部，漏入腹股沟淋巴结 (LN) 及两侧胸壁内侧到每个腋下漏入腋生巷过继转会需要 1-2 免疫的捐助小鼠每个收件人的老鼠。 2。T 细胞培养及炎性 T 细胞极化 10-12 天后免疫，从小鼠收集 LN。 在冰盘，准备 60 毫米的培养皿装有一个细胞过滤器 (网格大小 70 µ m) 和含冰鲜含 10%热灭活的胎牛血清 (FBS) 的 RPMI 媒体和 100 U/mL 青霉素 100 微克/毫升链霉素 （钢笔-链球菌） (RFP)。 Euthanize 小鼠暴露于 CO 2，其次是颈椎关节脱位。沉浸小鼠中 70%的乙醇，然后寄到夹层板每个于拦路贼。 从腹股沟切正中皮肤切口，脖子和到每条腿。拉肌肤远离腹膜和别针把它拉紧地向董事会。解剖腹股沟和腋窝 LN 和放入培养皿中 RFP，在冰上。 19 过继转移实验，结合 LN 从相同的免疫接种组内的所有动物。Vβ 使用流流式细胞仪分析，分开个别动物的 LN。 放置包含到含 RFP 50 毫升离心管 LN 的细胞过滤器。使用无菌 5 毫升注射器柱塞平端按 LN 细胞通过过滤器，用 20-30 毫升的 RFP，以便恢复单元格的清洗。维持在加工过程中，文化的时间直到冰上 LN 细胞。 洗两次，离心在 393 x g 5 分钟。后第二次洗，重悬 LN 细胞的 T 细胞媒体 (TCM)。中医包含用 RPMI 10%热灭活胎牛血清、 292 微克/毫升 L-谷氨酰胺、 110 微克/毫升丙酮酸钠，和 55 µ M 2-巯基乙醇和笔链球菌。通常情况下，使用的 5 毫升中医捐助鼠标每卷。 LN 单元格进行计数。预期收益率是大约 3-6 x 10 7 LN 细胞免疫的小鼠捐精者。留出 3-4 x 10 6 增殖测定 （见下面第 3 节）。 设置偏光文化为过继转移 (6 节)。 准备 Th17 偏光文化 5 x 10 6 LN 细胞每毫升 10 微克/毫升 Ag，20 吴/mL 重组小鼠白细胞介素 (IL)-23 和 10 吴/mL 重组小鼠白细胞介素-6 在中医。 另外，Th1 两极化，准备文化 5 x 10 6 LN 细胞每毫升 10 微克/毫升 Ag 和 10 吴/mL 重组小鼠白细胞介素-12 在中医。 加入 12 孔板每两极化的文化混合井 2 毫升 （1 × 10 7 细胞）。LN 小鼠细胞的 2-4 捐助将填补一个 12 孔板。保持文化在湿的孵化器在 37 ° C，5%CO 2 为 72 h. 目视检查 LN 细胞培养的激活在 48 小时和 72 h.活化细胞会形成广泛的集群和 T 细胞将增加规模，成为更多形性。代谢的增加将导致在媒体上，改从桃橙 ph 值降低。如果 pH 值低到足以变黄了媒体，添加 1 毫升新鲜中医防止对在其余 24 h.细胞毒性的 节 6 继续为过继转移。极化效率可核实染色 (ICS) 的细胞内细胞因子作为描述第 5 节中的部分。 设置文化流流式细胞术分析的表面 Vβ 表达 (节 4) 从个别老鼠使用 LN。 准备 5 x 10 6 每毫升 10 微克/毫升 Ag 在中医与 LN 细胞。 加入 12 孔板 2 毫升 （1 × 10 7 细胞） 的每口井的文化。文化应维持在一个湿的孵化器，在 37 ° C，5%CO 2 10 天。第 4 节继续。 3。增殖 注： 这种情况继续从 2.4 节。 准备的 LN 细胞在管中，在 2 × 10 3 4 毫升每毫升中医 6 细胞。 轻轻的逆变管多次，混合细胞，然后换乘不育槽。 使用到板 100 μ L 细胞每口井的多通道滴入 96 孔板圆底细胞培养板。通常情况下，板 15 口井，一式三份和试验的 4 种 Ag 浓度没有 Ag 参考。 稀释 Ag 在中医在不同浓度，通常 80、 20、 5、 1 和 0 微克/毫升 （2 x 股票）。在一式三份的终浓度为 40，10，2.5 中添加每个浓度 100 μ 的 L。0.5 和 0 微克/毫升。孵化为大约 72 小时 37 ° C. 注： 步骤通过 3.7 3.5 涉及放射性材料。正确使用方法、 监测和处置放射性材料应进行，按照体制和政府规定。 准备工作 3 H-胸苷股票溶液 (40 µCi/mL) 1 mCi 3 H-胸苷加入 25 毫升 RPMI，而存储这在 4 ° C.吸管 0.5 毫升的工作解决方案不育的槽里。 添加 25 µ L 的 3 H-胸苷 (1 µCi) 每好使用多通道的吸管。孵育额外 18 h 在 37 ° C. 收获细胞到使用 96 孔板细胞收割机玻璃过滤器垫子上，用 70%乙醇冲洗。干燥后，进用 5 毫升闪烁液的塑料样品袋密封过滤垫。在每个好使用闪烁计数器测量放射性。 4。细胞表面 TCR Vβ 表达的流式细胞分析 注： 这种情况继续从第 2.6 节。抗体的鼠标 TCR Vβ 2，3，4，5.1 和 5.2、 6、 7、 8.1 和 8.2、 8.3，9、 10b、 11、 12、 13、 14、 及 17a 条是商业上供测试 TCR Vβ 表达。 的 TCR Vβ 检测，取出 T 细胞培养板从吹打几次和细胞转移到一个管。 用流式细胞仪缓冲区 (FB) 含 2%胎牛血清，0.1%叠氮化钠和 2 毫米在 PBS 中 EDTA 清洗。 细胞转移到 V 形底 96年孔板，密度为 1 × 10 5 至 3 x 10 6 细胞每口井。这些细胞进入多个井 （Vβ 正在测试每一个井） 分布的整个 Vβ 小组正在进行测试，如果。 通过染色用活死可行性染料，与自由胺暴露的坏死细胞的反应，从流式细胞术分析排除死细胞。按照制造商 ' s 说明离心和再悬浮在可行性染料。10-20 分钟，整个细胞染色程序冰上孵育，保护细胞免受光和保持在冰面上 后孵化，洗板一次在 FB。若要检测 TCR Vβ，暂停在 100 μ L 的 FB 包含抗体 1: 100 稀释的 CD4 细胞 （克隆 RM4 5） 和 TCR Vβ。孵育 15-60 分钟在冰面上 在 FB 一次洗板和固定细胞通过添加 200 微升 4%多聚甲醛在 PBS 稀释。孵育 20 分钟在冰上。洗板在 FB 和流式细胞分析。 5。流流式细胞仪分析细胞内细胞因子生产 为细胞内细胞因子染色 (ICS)，对待 T 细胞文化与蛋白质运输抑制剂试剂 (例如，GolgiPlug) 1: 1000 稀释中医，ICS，防止前 4 h分泌细胞因子。在那个时候，激活 T 细胞与 50 吴/mL 佛 12-肉豆蔻 13-乙酸酯 (PMA) 和 500ml 吴 ionomycin 为了诱导蛋白生产。 后的文化在 37 ° C 的 4 h，取出细胞培养板吹打向上和向下，并将转移到离心管 （15 或 50 毫升）。 用 FB 洗净。重悬细胞在 FB 和转移到 V 形底 96年孔板，密度为 5 × 10 5 3 x 10 6 细胞每井。 染色细胞与可行性染料作为上述 （第 4.2 节）。孵育后洗板一次在 FB。 添加抗体检测的表面标记，如下所示： 的表面标志物的检测，暂停在 100 μ L 的 FB 包含抗体 1: 100 稀释的 CD4 细胞 （克隆 RM4-5）。 （可选） 包括抗体为 B220 （克隆 30 F11） 和 CD11b （克隆 M1/70） 1: 100 稀释，采用提高浇注的 B 细胞和单核细胞/巨噬细胞，分别。一般来说，PE Cy7 抗 CD4、 FITC 抗 B220 和 PerCP Cy5.5 抗 CD11b 工作好。抗体/荧光复合物的选择应遵循的流式细胞仪分析，用于配置和最优的抗体浓度应可根据经验确定。 孵育 15-60 分钟上冰。 FB 用洗板和重悬 200 微升的在冰上 20 分钟的固定/通透解决方案中的单元格。这将修复细胞和通透细胞细胞膜。 为了维持细胞膜在细胞内染色，通透而不是 FB 使用烫发/洗涤缓冲液 (PW) (稀释 1:10 从 10 X 股票)。洗井的 PW 200 微升。 为 ICS，制备抗体的 1: 100 稀释液干扰素 (IFN)-γ 和 IL-17A 使用 1 x PW。一种选择是 APC 抗 IFN-γ （克隆 XMG1.2） 和 PE 抗-IL-17A (克隆 eBio17B7)，效果很好。悬在 100 μ L 的鸡尾酒的胞内抗体的细胞，然后孵育至少 15 分钟。它也是可能继续染色一夜之间在 4 ° C. 洗井的 PW 200 微升和再悬浮在 FB 为流式。 并行，准备污泥而不染的样品 （FB 没有抗体细胞） 对优化检测器电压和单染色样品为每个个别的荧光染料 （即细胞或补偿珠沾上只有一个抗体/荧光）确定补偿溢出值。 使用流式细胞仪，获得 ≥ 一万个细胞 （事件），浇注上可行 （活/死-阴性） CD4 + 细胞。为了确保准确浇注的 T 细胞，排除 B220 + 和 CD11b + 细胞 (B 细胞和单核细胞/巨噬细胞，分别)。在 CD4 + T 细胞亚群、 确定细胞表达 IFN-γ （Th1 血统） 或 IL-17A （Th17 沿袭） 的百分比。 6。过继转移致病 AQP4 特异性 T 细胞 注： 此步骤如下从第 2.5 节： T 细胞文化和炎性 T 细胞极化。 恢复极化 12 孔板细胞吹打向上和向下取出，并将它们传送到 50 毫升管。马要保持直到注射冰上的。 单元格进行计数，两次在冷的 PBS，洗净，准备暂停 PBS 1 x 10 8 细胞/毫升。一般来说，在一个小时内注入细胞。 轻轻的旋转混合细胞和转移到 1 毫升注射器注射次。静脉内管理的细胞 (2 x 10 7) 200 微升 （静脉注射） 向每个鼠标，通过尾静脉。 注入每个收件人小鼠腹腔与 200 吴 B.百日咳 毒素稀释 200 µ L 的 PBS 在那一天和 2 天后。监测小鼠每日为临床疾病的迹象。 7。临床评估 ATCA 检查收件人小鼠每日为中枢神经系统自身免疫的临床症状。一般情况下，小鼠将显示中枢神经系统自身免疫的迹象后 AQP4 特异性 T 细胞过继转移 5-8 天。老鼠会显示神经功能障碍的临床症状。它有利于对天真鼠标来定义鼠标的正常能力进行评价。 评价小鼠尾巴损失的语气。轻轻握住小鼠尾基部，直立提起。枯萎不断是称为损失的尾巴尾巴音 （1 分）。尾巴的语气损失通常是临床疾病的第一迹象。 通过将鼠标放在一个平面上背上的 测试为扶正反射。缓慢的纠正是躯干共济失调的标志 （2 分）。天真的鼠标会完全抵制任何企图将它放在它的后面，所以任何缓慢的权利能力得分为功能障碍。它是典型的测试鼠标这反射 3-4 倍。 评估姿势和移动。老鼠开始显示变化导致降低或拖动的臀部在行走的姿势 （2.5 分）。进一步疾病结果在单瘫，一个后完全陷于瘫痪肢体 （3.0 分） 和截瘫，两后肢完全瘫痪肢体 （3.5 分）。适度四肢轻瘫为，所有的四肢，弱点会导致非常缓慢的向前移动 （4 分）。严重四肢轻瘫为允许几乎没有向前移动 （4.5 分）。最后，严重的疾病，他们可能成为垂死或死 （5 分）。 管理对小鼠失去的能力或者，获得流体或固体食物 1 毫升的生理盐水腹腔 5%葡萄糖液使用补充凝胶杯，高热量的凝胶和培根软弱来抵消脱水和剥夺食物。安乐死垂死老鼠。 8。组织编制和组织学 麻醉小鼠 100 毫克/公斤氯胺酮和甲苯噻嗪 10 毫克/公斤，然后销到夹层板每个于拦路贼。 开放了胸，暴露心脏。切开肝允许血液流出。附加到单独的储水槽用 PBS 和 10%的福尔马林 miniflow 变速泵油管的蝴蝶针。将针插入到心脏的左心室和灌注配合 5 毫升的 PBS，其次是 25 毫升 10%福尔马林。 删除头部，然后眼睛。过程的眼睛和视网膜前面所述 20。抄近路穿过眼窝、 插入剪刀在鼻子和每个侧面切开前-后头骨。 删除头骨、 揭露视神经、 切断视神经交叉置于之间 2 泡沫垫卡带。 在 10%福尔马林 （24 小时），然后 50%乙醇 （24 小时），然后转账到 70%的乙醇浸没。 移除大脑和脊柱，并将在 10%福尔马林。连续的部分大脑在冠状面;节脊髓索在矢状面 （大约一半） 和串行冠状面 （大约每次鼠标 20 截面）。 过程 CNS 样品常规石蜡包埋。染色 8 µ m 厚截面与苏木精和曙红 （视神经） 或勒快速蓝苏木精和曙红 （脑和脊髓）。 评价视神经炎症神经和周围脑膜 （视神经炎） 内或主要地在周围脑膜 （光纤 ③） 的存在。 计数脑膜和实质的炎症病灶 (> 10 聚集外周血单个核细胞) 在脑和脊髓样品，每个鼠标。 9。在体内视网膜成像的光学相干断层成像 (OCT) 注： 频域 OCT 视网膜成像的小鼠进行使用商用设备 （例如，Spectralis 与 TruTrack 眼动仪） 以实现一致的眼定位和减少运动伪影。 五分钟前成像，瞳孔与托吡卡胺 1%（每只眼睛看到一滴） 和放置鼠标成像在麻醉诱导室，提供源源不断的 2 升 / 分钟 （1.5%异氟醚）。打开热垫和准备麻醉后恢复笼。 将鼠标放置在成像滚筒上，因此麻醉流重定向。保护眼睛与 0.3%羟丙基甲基纤维素，保持眼睛湿润，确保折射连续性。眼要检查上放置自定义的隐形眼镜。 红外眼底图像，作指导直接激光对眼睛，确保梁中心视神经头上。垂直和水平 OCT 扫描应确认，视网膜激光奠定了垂直。 执行 25 B 扫描在高分辨率模式和栅格化从 30 平均 A 扫描。 后成像两只眼睛，取隐形眼镜，并涂眼用凝胶。在温暖的恢复笼子里离开鼠标。 10。处理和分析的 OCT 使用模块化成像软件的自动分割。 手动正确段对应内界膜 (ILM) 和内网状层 (IPL)，代表的限制内视网膜层 (IRL) 21. 验证视网膜神经纤维层 (RNFL) 和神经节细胞层 (GCL) 驻留在 IRL 范围内并不重叠。 计算 IRL 厚度与直径的 1、 2 和 3 毫米围绕视盘和导出到电子表格文件使用早期治疗糖尿病视网膜病变的研究 (ETDRS) 2 网格。软件计算每个视网膜层厚度由平均每个网格的部门。因此，中央部分，对应于视神经头，排除。 分析组在每个时间点的统计差异。分析对于每个鼠标，用两只眼睛广义估计方程与交换相关矩阵和调整内部学科间眼相关 21.