Yüksek çözünürlüklü tek hücre türleri morfoloji ve Glia Drosophila içinde etkileşimlerin hücre çalışmaya uygulama çok renkli FlpOut tekniği
Summary
Hücre türleri farklı morfoloji görüntülemek ve a değişiklik-in onların komşuları ile etkileşim kurmak. Bu iletişim kuralı tek hücre morfolojisi açıklamaya ve hücre-hücre etkileşim köklü Gal4/UAS ifade sistemi kullanılarak incelemek için açıklar.
Abstract
Hücreler farklı türleri morfoloji ve karmaşık anatomik ilişkileri görüntüler. Hücreleri onların komşuları ile nasıl etkileşimde bulunur? Etkileşimleri hücre tipleri arasında ya da belirli bir türün içinde farklı mıdır? Ne tür uzamsal kuralları takip ettiler? Böyle temel soru vivo yanıtları defa yüksek çözünürlüklü tek hücre etiketleme araçları eksikliği ile engel olmuştur. Burada, bir çok renkli FlpOut (MCFO) tekniği ile tek hücreleri hedef için detaylı bir protokol sağlanır. Bu yöntem iki FRT siteleri (FRT-dur-FRT) tarafından çevrili bir transkripsiyon Sonlandırıcı sessiz tutulduğu üç farklı şekilde etiketlenmiş gazetecilere (HA, bayrak ve V5) UAS kontrol altında kullanır. Isı şok nabzı rastgele tek tek hücreleri FRT-dur-FRT kaset kaldıran bir ısı şok kaynaklı Flp recombinase, ifadesi indükler: ifade yalnızca aynı zamanda bir GAL4 sürücü hızlı hücrelerinde oluşur. Bu farklı renkli hücreleri tek hücre türleri Morfoloji görselleştirme sağlar yüksek çözünürlükte bir belli bir hücre türü bir dizi yol açar. Örnek olarak, MCFO teknik türleri Morfoloji yetişkin Drosophila beyinde farklı gliyal türlerinden görselleştirmek için belirli gliyal GAL4 sürücüleri ile kombine edilebilir.
Introduction
Glia, sinir sistemi (NS), Sigara nöronal hücre nüfusu uzun nöronlar için statik bir çerçeve sağlamak sayıyorlar ve bu nedenle ayrıntılı olarak incelenmiştir değil. Ancak, insanlar, glia hücreleri NS (~ %90) büyük çoğunluğu teşkil ve astrocytes, oligodendrocytes, microglia ve Schwann hücreleri de dahil olmak üzere, birkaç farklı kategoride toplanır. Drosophilaiçinde glia hücreleri NS yaklaşık yüzde 10’u oluşturmaktadır. Çoğu intriguingly konularda, kendi türleri morfoloji ve işlevleri omurgalılar1,2‘ bulunanlara benzer. Kendi türleri Morfoloji epiteli, ensheathing ve astrocyte benzeri hücreler oluşturan kan – beyin bariyerini (BBB) içerir.
Drosophila merkezi sinir sistemi (MSS) aşağıdaki temel yapıdan oluşur: nöronal hücre organları; içeren korteksin bölgeleri Sinaptik bağlantıları liman neuropils; farklı neuropiles bağlanan küçük ve büyük axon yolları; duyu organları ve kaslar MSS (şekil 1) ile bağlanan periferik sinirler. Glia anatomik yapılarla ilişkili bulunur: korteks glia (CG) kortikal bölgelerde astrocyte benzeri glia (ALG) ve neuropile bölgelerinde, ensheathing glia ensheathing glia (EG) ayrıca merkezi axon yolları ve çevre birimi ile ilişkili vardır sinirler (EGN) ve son olarak, iki sayfa benzeri glia, perineurial glia (PG) ve subperineurial (SPG), hangi birlikte tüm NS (Şekil 2) kapsayan bir bitişik katman oluşturur.
Önceki çalışmalarda bu glia göstermiştir NS; gelişiminde önemli rol oynarlar Onlar için sistemik dolaşımdaki İnsülin benzeri peptidler tepki nöronal hücre sayıları izlemek, nöronlar, astrocyte-nöron laktat Servisi gibi trofik destek sağlamak ve ölen nöronlar fagositoz3,4 tarafından ortadan kaldırmak , 5 , 6. olgun NS glia BBB korumak, nörotransmitter kadar almak ve iyonik homeostazı korumak, NS, büyük bağışıklık hücreleri olarak hareket beri makrofajlar BBB ihlal ve sinirsel aktivite yanı sıra hayvan davranışları6 modüle , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
Olup farklı gliyal alt türlerinden özel işlevleri gerçekleştirmek önemli bir açık soru kalır. Ancak, glia, özellikle, Yetişkin, sistematik bir genom geniş analizi uygun genetik araçlar onların manipülasyon için eksikliği ile engel olmuştur. Burada, cep şekilleri karmaşık hücre-hücre etkileşimleri çalışmaya verimli ve kolay karakterizasyonu sağlayan bir yöntem sunulur. Bu teknik yetişkin Drosophila beyinde farklı gliyal türlerinden morfolojisi karakterize etmek için uygulanan, ancak kullanılan belirli GAL4 sürücüsüne bağlı olarak bu nöronların12,13 çalışmaya adapte , herhangi bir hücre birbirine karışmasının ve prensipte herhangi bir gelişim aşamalarında herhangi bir doku.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralı bir doku yüksek çözünürlükte ilgi içinde farklı hücre türleri morfolojisi çalışmaya kolay ve etkin bir yöntem açıklanır. MCFO tekniği ile farklı epitope etiketleri ile birden fazla gazetecilere çok renkli Stokastik (Şekil 2) etiketleme için birlikte kullanılır. Benzer şekilde Brainbow/Flybow15,16,17gibi diğer yöntemleri, MCFO hücre-hücre etkileşim ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Arnim Jenett, Aljoscha Nern ve Rubin laboratuvar tavsiye için diğer üyeleri ve yayınlanmamış reaktifler ve Janelia uçmak ışık projesi confocal görüntüleri oluşturmak için takım paylaşım teşekkür ederim. Yazarlar ayrıca el yazması üzerinde yorumlar için Galya laboratuvar üyeleri teşekkür ederiz.
Materials
| Water bath | Grant | GD100 | |
| PCR tubes | Sarstedt | 72.737.002 | |
| Forceps | Dumont | 11251-20 | |
| Dissecting dish 30 mm x 12 mmm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dish |
| Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate | Corning | 7223-34 | Glass dissection plates |
| Sylgard Black | SYLGARD, Sigma-Aldrich | 805998 | home made with charcoal |
| ExpressFive S2 cell culture medium | Invitrogen | 10486-025 | |
| 20% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Roth | 3051.3 | |
| Normal goat serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | |
| Normal donkey serum | Jackson Laboratories | 017-000-121 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| Rabbit HA-tag | Cell Signaling | C29F4 | Primary antibody, dilution 1:500 |
| Rat FLAG-tag | Novus Biologicals | NBP1-06712 | Primary antibody, dilution 1:100 |
| Mouse V5-tag:DyLight 549 | AdSerotec | 0411 | Conjugated antibody, dilution 1:200 |
| anti-rabbit AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11034 | Secondary antibody, dilution 1:250 |
| anti-rat DyLight 647 | Jackson Laboratories | 712-605-153 | Secondary antibody, dilution 1:100 |
| Vecta Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SlowFate Gold | Invitrogen | S36937 | |
| Secure Seal Spacer | Grace Biolabs | Contact company for ordering | |
| Microscope cover glass 22 X 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Microscope cover glass 22 x 22 mm | Roth | H874 | |
| Stereo Microscope, Leica MZ6 | Leica | ||
| Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | ||
| Immersol | Zeiss | 518 F | Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free |
| Immersol | Zeiss | W 2010 | Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free |
| R56F03-GAL4 (EG) | Bloomington Stock Center | 39157 | GAL4 driver |
| R86E01-GAL4 (ALG) | Bloomington Stock Center | 45914 | GAL4 driver |
| hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5 | Bloomington Stock Center | 64085 | UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php) |
| Fiji (Image J) | Image analysis software | ||
| Multi Time Macro | Zeiss | Software for automated scanning |
References
- Freeman, M. R., Doherty, J. Glial cell biology in Drosophila and vertebrates. Trends Neurosci. 29 (2), 82-90 (2006).
- Stork, T., Bernardos, R., Freeman, M. R. Analysis of glial cell development and function in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (1), 1-17 (2012).
- Corty, M. M., Freeman, M. R. Cell biology in neuroscience: Architects in neural circuit design: Glia control neuron numbers and connectivity. J Cell Biol. 203 (3), 395-405 (2013).
- Hidalgo, A., Kato, K., Sutcliffe, B., McIlroy, G., Bishop, S., Alahmed, S. Trophic neuron-glia interactions and cell number adjustments in the fruit fly. Glia. 59 (9), 1296-1303 (2011).
- Liu, J., Speder, P., Brand, A. H. Control of brain development and homeostasis by local and systemic insulin signalling. Diabetes Obes Metab. 16, 16-20 (2014).
- Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons. Cell. 133 (3), 498-509 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Edenfeld, G., Stork, T., Klambt, C. Neuron-glia interaction in the insect nervous system. Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 34-39 (2005).
- Oland, L. A., Tolbert, L. P. Key interactions between neurons and glial cells during neural development in insects. Annu Rev Entomol. 48, 89-110 (2003).
- Stork, T., Sheehan, A., Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. Neuron-glia interactions through the Heartless FGF receptor signaling pathway mediate morphogenesis of Drosophila astrocytes. Neuron. 83 (2), 388-403 (2014).
- Zwarts, L., Van Eijs, F., Callaerts, P. Glia in Drosophila behavior. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 201 (9), 879-893 (2015).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Svoboda, K., Rubin, G. M. Multiple new site-specific recombinases for use in manipulating animal genomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (34), 14198-14203 (2011).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (22), E2967-E2976 (2015).
- Viswanathan, S., Williams, M. E., Bloss, E. B., Stasevich, T. J., Speer, C. M., Nern, A., Pfeiffer, B. D., Hooks, B. M., Li, W. P., English, B. P., Tian, T., Henry, G. L., Macklin, J. J., Patel, R., Gerfen, C. R., Zhuang, X., Wang, Y., Rubin, G. M., Looger, L. L. High-performance probes for light and electron microscopy. Nat Methods. 12 (6), 568-576 (2015).
- Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Hampel, S., Chung, P., McKellar, C. E., Hall, D., Looger, L. L., Simpson, J. H. Drosophila Brainbow: A recombinase-based fluorescence labeling technique to subdivide neural expression patterns. Nat Methods. 8 (3), 253-259 (2011).
- Hadjieconomou, D., Rotkopf, S., Alexandre, C., Bell, D. M., Dickson, B. J., Salecker, I. Flybow: Genetic multicolor cell labeling for neural circuit analysis in Drosophila melanogaster. Nat Methods. 8 (3), 260-266 (2011).
- Kremer, M. C., Jung, C., Batelli, S., Rubin, G. M., Gaul, U. The glia of the adult Drosophila nervous system. Glia. 65 (4), 606-638 (2017).
