Summary

Применение методики многоцветной FlpOut для изучения морфологии одноклеточного высокого разрешения и взаимодействия клеток глии в дрозофилы

Published: October 20, 2017
doi:

Summary

Клетки отображать различные морфологии и установить различные взаимодействия со своими соседями. Этот протокол описывает раскрыть морфология одиночных клеток и исследовать взаимодействия ячеек с помощью хорошо отлаженная система Gal4/Уан выражение.

Abstract

В ячейках отображаются различные морфологии и сложные анатомические взаимоотношения. Как клетки взаимодействуют с их соседями? Отличаются ли взаимодействие между типами клетки или даже в пределах данного типа? Какие виды пространственных правил они следуют? Ответы на такие фундаментальные вопросы в vivo пока сдерживаются отсутствием инструментов для маркировки одноклеточного высокого разрешения. Здесь приводится подробный протокол для одиночных клеток с техникой многоцветной FlpOut (MCFO). Этот метод опирается на три по-разному тегами Репортеры (HA, флаг и V5) под контролем UAS которые хранятся немого transcriptional Терминатор, окруженный двумя FRT мест (FRT-стоп FRT). Ударный импульс тепла Индуцирует экспрессию теплового шока индуцированной ФЛП рекомбиназа, который случайно удаляет FRT-стоп FRT кассеты в отдельных клетках: выражение происходит только в клетках, которые также express драйвер GAL4. Это приводит к массив по-разному окрашенных клеток типа ячейки, который позволяет визуализировать морфологии отдельных клеток с высоким разрешением. Например метод MCFO может сочетаться с драйверам глиальных GAL4 для визуализации морфологии различные подтипы глиальных в мозге взрослого дрозофилы .

Introduction

Глии, население не нейрональных клеток нервной системы (NS), давно считается статическим основу для нейронов и поэтому не были изучены в деталях. Однако в организме человека, глии составляют подавляющее большинство клеток в NS (~ 90%) и делятся на несколько различных категорий, в том числе астроциты, олигодендроциты, Микроглия и Шванновские клетки. У дрозофилыглии составляют около 10% ячеек в NS. Интригующе их морфологии и функции удивительно похожи на те, нашли в позвоночных1,2. Их морфологии включают гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) формирование эпителия, ensheathing и экзоцитоз подобных клеток.

Дрозофилы центральной нервной системы (ЦНС) состоит из следующих основных структур: области коры, которые содержат нейрональных клеток органов; neuropils, что гавань синаптических связей; аксон малые и большие участки, которые соединяют разные neuropiles; периферических нервов, которые связывают органы чувств и мышцы с ЦНС (рис. 1). Глии находятся связанные с все эти анатомические структуры: глии (CG) коры в кортикальной регионах, экзоцитоз как ГЛИА (ALG) и глии (EG) ensheathing в neuropile регионах, глии ensheathing также связаны с Центральной аксона участки и периферической нервы (EGN) и, наконец, два листа, как ГЛИА, perineurial глии (PG) и subperineurial (SPG), которые вместе образуют непрерывный слой, который охватывает весь NS (рис. 2).

Предыдущие исследования показали, что глии играют важную роль в развитии НС; они контролировать число нейрональных клеток, реагируя на системно циркулирующих инсулин как пептиды, трофических оказывать нейронов, например экзоцитоз нейрон лактат шаттл и ликвидации умирающего нейронов фагоцитоза3,4 , 5 , 6. в зрелых NS, глии поддерживать BBB, занимают нейротрансмиттеров и поддержания ионного гомеостаза, выступать в качестве основных иммунные клетки в НС, так как макрофаги не может нарушать BBB и модулировать синаптической активности, а также поведение животных6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.

Ли различные подтипы глиальных выполняют специализированные функции, важный вопрос остается открытым. Однако систематический анализ генома общесистемной глии, особенно в взрослых, была затруднена отсутствием соответствующих генетических инструментов для их обработки. Здесь представлен метод, который позволяет легко и эффективно характеристика форм клеток для изучения взаимодействия сложных ячеек. Этот метод был применен к характеризуют морфология различные подтипы глиальных в мозге взрослого дрозофилы , но, в зависимости от конкретного драйвера GAL4 используются, могут быть адаптированы для изучения нейронов12,13 , каких-либо смешения клеток и в принципе любой ткани в любой стадии развития.

Protocol

1. Подготовка мух для экспериментов многоцветной FlpOut (MCFO) Примечание: MCFO техника относится к модифицированную версию так называемые ФЛП опосредованной остановить кассету эксцизии (FlpOut). Трансгенные MCFO мух нести теплового шока промоутер (ХПП)-ФЛП рекомбиназа и различных ж?…

Representative Results

Этот раздел иллюстрирует примеры результатов, которые могут быть получены с помощью метода MCFO в мозге взрослого дрозофилы . На рисунке 3 показана схема метода. Три по-разному мембраны тегами журналистов (myr-smGFP ха, myr-smGFP флаг и myr-smGFP-V5) под к?…

Discussion

Этот протокол описывает простой и эффективный метод для изучения морфологии различных типов клеток в ткани интерес с высоким разрешением. С MCFO техникой несколько репортеров с различных эпитопов Теги используются в сочетании для многоцветного стохастических маркировки (ри…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарят Арним Jenett, Aljoscha Нёрн и другие члены Рубин лаборатории для консультаций и совместное использование неопубликованных реагентов и Janelia летать свет команде проекта для создания конфокальный изображений. Авторы также поблагодарить членов в Галлии лаборатории для комментариев на рукопись.

Materials

Water bath Grant GD100
PCR tubes Sarstedt 72.737.002
Forceps Dumont 11251-20
Dissecting dish 30 mm x 12 mmm Electron Microscopy Sciences 70543-30 Glass dissection dish
Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate Corning 7223-34 Glass dissection plates
Sylgard Black SYLGARD, Sigma-Aldrich 805998 home made with charcoal
ExpressFive S2 cell culture medium Invitrogen 10486-025
20% PFA Electron Microscopy Sciences 15713
Triton X-100 Roth 3051.3
Normal goat serum Jackson Laboratories 005-000-121
Normal donkey serum Jackson Laboratories 017-000-121
Bovine Serum Albumin Sigma A9647
Rabbit HA-tag Cell Signaling C29F4 Primary antibody, dilution 1:500
Rat FLAG-tag Novus Biologicals NBP1-06712 Primary antibody, dilution 1:100
Mouse V5-tag:DyLight 549 AdSerotec 0411 Conjugated antibody, dilution 1:200
anti-rabbit AlexaFluor 488 Invitrogen A11034 Secondary antibody, dilution 1:250
anti-rat DyLight 647 Jackson Laboratories 712-605-153 Secondary antibody, dilution 1:100
Vecta Shield Vector Laboratories H-1000
SlowFate Gold Invitrogen S36937
Secure Seal Spacer Grace Biolabs Contact company for ordering
Microscope cover glass 22 X 60 mm Marienfeld 101152
Microscope cover glass 22 x 22 mm Roth H874
Stereo Microscope, Leica MZ6 Leica
Confocal laser scanning microscope LSM710 Zeiss
Immersol Zeiss 518 F Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free
Immersol Zeiss W 2010 Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free
R56F03-GAL4 (EG) Bloomington Stock Center 39157 GAL4 driver
R86E01-GAL4 (ALG) Bloomington Stock Center 45914 GAL4 driver
hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5 Bloomington Stock Center 64085 UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)
Fiji (Image J) Image analysis software
Multi Time Macro Zeiss Software for automated scanning

References

  1. Freeman, M. R., Doherty, J. Glial cell biology in Drosophila and vertebrates. Trends Neurosci. 29 (2), 82-90 (2006).
  2. Stork, T., Bernardos, R., Freeman, M. R. Analysis of glial cell development and function in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (1), 1-17 (2012).
  3. Corty, M. M., Freeman, M. R. Cell biology in neuroscience: Architects in neural circuit design: Glia control neuron numbers and connectivity. J Cell Biol. 203 (3), 395-405 (2013).
  4. Hidalgo, A., Kato, K., Sutcliffe, B., McIlroy, G., Bishop, S., Alahmed, S. Trophic neuron-glia interactions and cell number adjustments in the fruit fly. Glia. 59 (9), 1296-1303 (2011).
  5. Liu, J., Speder, P., Brand, A. H. Control of brain development and homeostasis by local and systemic insulin signalling. Diabetes Obes Metab. 16, 16-20 (2014).
  6. Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons. Cell. 133 (3), 498-509 (2008).
  7. Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
  8. Edenfeld, G., Stork, T., Klambt, C. Neuron-glia interaction in the insect nervous system. Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 34-39 (2005).
  9. Oland, L. A., Tolbert, L. P. Key interactions between neurons and glial cells during neural development in insects. Annu Rev Entomol. 48, 89-110 (2003).
  10. Stork, T., Sheehan, A., Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. Neuron-glia interactions through the Heartless FGF receptor signaling pathway mediate morphogenesis of Drosophila astrocytes. Neuron. 83 (2), 388-403 (2014).
  11. Zwarts, L., Van Eijs, F., Callaerts, P. Glia in Drosophila behavior. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 201 (9), 879-893 (2015).
  12. Nern, A., Pfeiffer, B. D., Svoboda, K., Rubin, G. M. Multiple new site-specific recombinases for use in manipulating animal genomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (34), 14198-14203 (2011).
  13. Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (22), E2967-E2976 (2015).
  14. Viswanathan, S., Williams, M. E., Bloss, E. B., Stasevich, T. J., Speer, C. M., Nern, A., Pfeiffer, B. D., Hooks, B. M., Li, W. P., English, B. P., Tian, T., Henry, G. L., Macklin, J. J., Patel, R., Gerfen, C. R., Zhuang, X., Wang, Y., Rubin, G. M., Looger, L. L. High-performance probes for light and electron microscopy. Nat Methods. 12 (6), 568-576 (2015).
  15. Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  16. Hampel, S., Chung, P., McKellar, C. E., Hall, D., Looger, L. L., Simpson, J. H. Drosophila Brainbow: A recombinase-based fluorescence labeling technique to subdivide neural expression patterns. Nat Methods. 8 (3), 253-259 (2011).
  17. Hadjieconomou, D., Rotkopf, S., Alexandre, C., Bell, D. M., Dickson, B. J., Salecker, I. Flybow: Genetic multicolor cell labeling for neural circuit analysis in Drosophila melanogaster. Nat Methods. 8 (3), 260-266 (2011).
  18. Kremer, M. C., Jung, C., Batelli, S., Rubin, G. M., Gaul, U. The glia of the adult Drosophila nervous system. Glia. 65 (4), 606-638 (2017).

Play Video

Cite This Article
Batelli, S., Kremer, M., Jung, C., Gaul, U. Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila. J. Vis. Exp. (128), e56177, doi:10.3791/56177 (2017).

View Video