Gebruik van capsules voor negatief vlekken van virale monsters in biocontainment
Summary
Dit protocol bevat instructies voor negatieve kleuring virusmonsters die gemakkelijk in BSL-2, -3 of -4 laboratoria kunnen worden gebruikt. Het omvat het gebruik van een innovatieve verwerkingscapule die het transmissie-elektronenmicroscopie rooster beschermt en de gebruiker makkelijker in de meer turbulente omgevingen in biocontainer vergemakkelijkt.
Abstract
Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) wordt gebruikt om de ultrastructuur van virussen en andere microbiële pathogenen met nanometeroplossing in acht te nemen. De meeste biologische materialen bevatten geen dichte elementen die elektronen kunnen verstrooien om een beeld te creëren; Daarom is een negatieve vlek die dikke zware metalen zouten rond het monster plaatst nodig. Om virussen in suspensie onder de TEM te visualiseren, moeten ze toegepast worden op kleine roosters die bedekt zijn met een doorzichtig oppervlak dat alleen nanometer dik is. Vanwege hun kleine grootte en breekbaarheid zijn deze roosters moeilijk te hanteren en gemakkelijk verplaatst door luchtstromen. Het dunne oppervlak is gemakkelijk beschadigd, waardoor het monster moeilijk of onmogelijk is om de afbeelding te maken. Infectieuze virussen moeten in een biosafety-kabinet (BSC) worden behandeld, en sommige hebben een biocontainende laboratoriumomgeving nodig. Staining virussen in biosafety niveaus (BSL) -3 en -4 is bijzonder uitdagend omdat deze omgevingen meer turbulent zijn en technici nodig zijn tO Persoonlijke beschermende uitrusting dragen (PPE), wat de handigheid vermindert.
In deze studie hebben we een nieuw apparaat geëvalueerd om te helpen bij negatieve kleuringvirussen in biocontainment. Het apparaat is een capsule die werkt als een gespecialiseerde pipettip. Zodra grids in de capsule zijn geladen, aspireert de gebruiker simpelweg reagentia in de capsule om het virus en vlekken aan het ingekapselde rooster af te leveren, waardoor gebruikersbehandeling van roosters wordt verwijderd. Hoewel deze techniek speciaal is ontworpen voor gebruik in BSL-3 of -4 biocontainment, kan het monsterbereiding in elke laboratoriumomgeving vergemakkelijken door makkelijk negatief kleuring van het virus mogelijk te maken. Dezezelfde methode kan ook toegepast worden om negatieve gekleurde TEM-monsters van nanodeeltjes, macromoleculen en dergelijke exemplaren op te stellen.
Introduction
Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) is een effectief instrument om de morfologie en ultrastructuur van biologische monsters te zien die te klein zijn om te zien in een traditionele lichtmicroscoop 1 , 2 , 3 , 4 . TEMs schiet elektronen door een zeer dun specimen dat een hogere resolutie beeld produceert, omdat elektronen een veel kortere golflengte hebben dan licht. Regio's van de steekproef die elektronen buigen of blokkeren, verschijnen donker, terwijl gebieden die elektronenlucent zijn, wit verschijnen.
Gebrek aan elektronen dichte materie maakt virussen moeilijk om te zien onder een TEM omdat ze elektronen niet kunnen verstrooien. Negatieve kleuring is de meest voorkomende methode voor het maken van contrast en het bekijken van virussen met een TEM. De eerste negatieve kleurprocedure werd in 1959 door Brenner en Horne voorgesteld, gebaseerd op een experiment waar Hall (1955) en Huxley (1957) observerenBij het verschijnen van biologische structuren in omgekeerd contrast wanneer ze gedompeld worden in een elektrondichte stof 5 . Het proces van negatieve kleuring is in de afgelopen halve eeuw vrijwel ongewijzigd. Negatieve kleuring houdt kort in het toepassen van een zware metalen zoutoplossing op een monster op een TEM-raster in een poging om het virus te omringen met dicht materiaal zonder het virus te infiltreren 6 . Dit creëert een donkere grens en onthult de vorm 5 van het deeltje. In deze studie worden twee reagentia gebruikt voor negatieve kleuring, uranylacetaat (UA) en kaliumfosphotungsticzuur (PTA). Beide deze vlekken worden vaak gebruikt om kleine biologische monsters te negeren, zoals virussen, eiwitcomplexen en nanodeeltjes 7 , 8 , 9 .
De conventionele negatieve kleuringstechniek is de handmatige druppel negatieve kleuringstechniekNique 7 . Deze methode vereist nauwkeurige behandeling van kleine, breekbare TEM-rasteren met pincet om kleine hoeveelheden virusmonster, vlek en spoelwater toe te passen. Het typische voorbereidingsprotocol omvat het aanbrengen van een druppel monsterophanging op het oppervlak van een filmomhulde TEM-rooster ( Figuur 1A ). Na het aanbrengen van het monster op het filmoppervlak wordt het rooster afgespoeld om niet-bijhanden virus te verwijderen en gedurende enkele seconden tot een minuut met ofwel UA of PTA gekleurd, afhankelijk van het type monster. Overmatige vloeistof is slecht weg van het raster door een stuk filterpapier aan de rand van het raster aan te raken.
De handmatige druppelmethode vereist dat elk raster individueel gemaakt wordt. Als het niet zorgvuldig wordt behandeld, kunnen de gecoate TEM-roosters gemakkelijk worden gebogen, gebogen of besmet. Het verwerken van meerdere monsters kan leiden tot problemen bij het bijhouden van de roosters en het verzekeren van consistente kleuring voor elk monster. Deze handleiding kleuring procedure is veel meer dEfficiënt wanneer uitgevoerd in biosafety-niveau (BSL) -3 en -4 biocontainerlaboratoria, vanwege de benodigde persoonlijke beschermingsmiddelen (PPE) die nodig zijn voor deze omgevingen. PPE is omslachtig en de biocontainermilieu is veel turbulent in vergelijking met een regulier laboratorium. Personeel in BSL-3 biocontainerlaboratoria moet 2 paren handschoenen dragen en in een biosafety-kast (BSC) werken. Deze dubbele laag handschoenen vermindert de gevoelige gevoeligheid en beperkt de fijne motorbeweging. De luchtstroom van het BSC dat de gebruiker beschermt en de verontreiniging van het monster voorkomt, kan ervoor zorgen dat de monsters en vlekken te snel drogen, waardoor de vlekkwaliteit wordt beïnvloed. De sterke turbulente luchtstroom in het BSC kan ook snel een raster dat niet goed beveiligd is, wegblazen. In BSL-4 biocontainende laboratoria zijn er extra veiligheidseisen. Personeel moet een positief drukpak dragen, waardoor de fysieke beweging verder wordt beperkt en het vermogen om duidelijk te zien en te manipulerenUlate grids. De technicus die in BSL-4 werkt, draagt ook minimaal 2 paar handschoenen, waarbij het buitenste paar een dikke handschoen is die de handvaardigheid en tactiele sensatie aanzienlijk vermindert. Tenslotte zijn de pinnen die gebruikt worden om TEM-rasters aan te pakken scherp, waardoor de technicus een risico oplevert vanwege hun vermogen om handschoenen te punken. Met capsules die roosters bevatten, zijn er geen tanggen nodig, waardoor een veilig, pincetvrij alternatief voor het manipuleren van roosters in biocontainering is. Tenslotte bieden de capsules ook een effectieve manier om rasters op te slaan tijdens de verwerking, de ontsmetting van osmiumdampen en tijdens de opslag; Waardoor de roosters georganiseerd en veilig zijn tegen schade.
In dit rapport introduceren we een nieuwe methode voor negatieve kleuring TEM-rasteren in biocontainerlaboratoria die mPrep / g capsules, een capsule-based apparaat voor roosterbehandeling en kleuring 10 , 11 , 12 gebruiken . De capsule komt erbijModelleert twee TEM-rasters, minimaliseert directe handhaving en vermindert het potentieel voor roosterschade. De capsule hecht direct op een enkel- of multikanaalspipet op dezelfde manier als een pipettip, waardoor de toepassing van verschillende vloeistoffen op rasters in de binnenkant mogelijk is. Dit maakt het gelijktijdig mogelijk om meerdere monsters met dubbele rasters te maken ( figuur 1B ). Naar negatieve vlekken met capsules wordt het virusmonster in de capsule gesuspendeerd en 10 minuten gehouden om de virussen op de gridoppervlakken te adsorberen. De roosters met geadsorbeerd virus worden vervolgens gewassen met gedeïoniseerd (dl) water en gedurende enkele seconden tot 1 minuten met enten UA of PTA gekleurd. Dit proces maakt gebruik van dezelfde protocol stappen en reagentia als de handmatige druppel methode; Het verschil is dat alle werkzaamheden binnen de capsule optreden zonder fysieke hantering van de roosters. ( Figuren 1C , 1D ).
Het doel van deze studie was om capsules te evalueren alsEen nieuwe methode voor negatieve kleuring van virusmonsters in biocontaineromgevingen. In deze studie werd ook gekeken naar de kwaliteit van TEM-beelden die zijn geproduceerd uit twee verschillende virusinactivatieprocedures: 1) snelle inactivering, 1% osmiumtetroxide-damp en 2) een 24 uur inactivatie met 2% glutaraldehyde. Beide deze werden uitgevoerd met behulp van de capsules. Tenslotte hebben we twee vaak gebruikte negatieve vlekken, UA en PTA geëvalueerd voor gebruik in de capsule. 13
Protocol
Representative Results
Discussion
Negatieve kleuring is een waardevolle TEM-techniek voor het evalueren en sorteren van virussen, eiwitcomplexen en nanodeeltjes. Druppelbereiding van deze monsters door het handmatig verplaatsen van grids van reagens tot negatieve vlekken is het klassieke protocol voor meer dan een halve eeuw. Het is een simpel proces, maar vereist expertise opgedaan door opleiding voor succesvolle afronding. Uitstekende negatieve kleuring wordt nog steeds beschouwd als een state-of-the-art vaardigheidsset en zeer gewenst in veel TEM lab…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. John Carra en Rowena Schokman willen ons danken en bedanken voor het leveren van gezuiverde Ebola nano-VLP's, Dr. Rajini Mudhasani voor het leveren van Chikungunya-virus en Dr Charles (Jason) Shoemaker voor het leveren van Murine Leukemia VLP's die Ebolavirus glycoproteïnen uitdrukken. Wij danken ook MAJ Carl Soffler voor het faciliteren van het Summer Internship Program (SIP) en het Science and Engineering Apprenticeship Program (SEAP) en Dr. Catherine Wilhelmsen voor de lab safety training.
Materials
| Formvar/carbon coated TEM grids | SPI | 3420C-MB | 200 mesh Cu Pk/100 |
| mPrep/g capsules | EMS | 85010-01 | box |
| mPrep/g couplers | EMS | 85010-11 | standard 16/Pk |
| glutaraldehdyde | EMS | 16320 | 50% solution, EM grade |
| Osmium Tetroxide | EMS | 19190 | 4% aqueous solution |
| Uranyl Acetate | EMS | 22400 | powder |
| Potassium phosphotungstic acid | EMS | 19500 | powder |
| filter paper | Whatman | 1450-090 | size 50 |
| Tranmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1011 | TEM |
References
- Gentile, M., Gelderblom, H. R. Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update. New Microbiol. 37 (4), 403-422 (2014).
- Kruger, D. H., Schneck, P., Gelderblom, H. R. Helmut Ruska and the visualisation of viruses. Lancet. 355 (9216), 1713-1717 (2000).
- Curry, A., Appleton, H., Dowsett, B. Application of transmission electron microscopy to the clinical study of viral and bacterial infections: present and future. Micron. 37 (2), 91-106 (2006).
- Goldsmith, C. S., Miller, S. E. Modern uses of electron microscopy for detection of viruses. Clin Microbiol Rev. 22 (4), 552-563 (2009).
- Kiselev, N. A., Sherman, M. B., Tsuprun, V. L. Negative staining of proteins. Electron Microsc Rev. 3 (1), 43-72 (1990).
- Brenner, S., Horne, R. W. A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses. Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).
- Harris, J. R. Negative staining of thinly spread biological samples. Methods Mol Biol. 369, 107-142 (2007).
- Bradley, D. E. Ultrastructure of bacteriophage and bacteriocins. Bacteriol Rev. 31 (4), 230-314 (1967).
- Suzuki, H., et al. Effects of two negative staining methods on the Chinese atypical rotavirus. Arch Virol. 94 (3-4), 305-308 (1987).
- Benmeradi, N., Payre, B., Goodman, S. L. Easier and Safter Biological Staining: High Contrast Uranyless Staining of TEM Grids using mPrep/g Capsules. Microsc Microanal. 21, 721 (2015).
- Goodman, S. L., Wendt, K. D., Kostrna, M. S., Radi, C. Capsule-Based Processing and Handling of Electron Microscopy Specimens and Grids. Microscopy Today. 23 (5), 30-37 (2015).
- Goodman, S. L., Kostrna, M. S. Reducing Reagent Consumption and Improving Efficiency of Specimen Fixation and Embedding, Grid Staining and Archiving using mPrep Capsule Processing. Microsc Microanal. 17, 174-175 (2011).
- Monninger, M. K., et al. Preparation of viral samples within biocontainment for ultrastructural analysis: Utilization of an innovative processing capsule for negative staining. J Virol Methods. 238, 70-76 (2016).
- Rossi, C. A., et al. Evaluation of ViroCyt(R) Virus Counter for rapid filovirus quantitation. Viruses. 7 (3), 857-872 (2015).
- Carra, J. H., et al. A thermostable, chromatographically purified Ebola nano-VLP vaccine. J Transl Med. 13, 228 (2015).
- Rein, A. Murine leukemia viruses: objects and organisms. Adv Virol. , 403419 (2011).
- Barland, M., Rojkind, Negative staining with osmium tetroxide vapour. Nature. 212 (5057), 84-85 (1966).
