Utilizzo di una zanzara ricombinante Densovirus come un vettore di consegna del Gene per l'analisi funzionale di geni in larve di zanzara

Zanzara di malattie come la malaria, la febbre dengue, febbre zika e febbre gialla, sono problemi di salute pubblica internazionale che continuano a rappresentare una frazione significativa della malattia infettiva globale onere^1,2. Insetticidi convenzionali, che sono stati utilizzati in risposta a vettori, sono una componente importante della strategia di controllo della zanzara integrato sostenibile per la prevenzione delle malattie trasmesse dalle zanzare. Tuttavia, tali strategie hanno dimostrato di essere relativamente inefficace o indesiderabili dovuto gli impatti ambientali negativi associati così come l’evoluzione della resistenza nella zanzara popolazioni^3,4. Per questi motivi, c’è un urgente bisogno di metodi alternativi di zanzara controllo e l’uso di metodi transgenici per produrre zanzare maschile sterile e il rilascio di zanzare patogeno-resistente sono sorti come promettenti nuove strategie di controllo. Per sviluppare un controllo efficace nuovi metodi, come approcci sicuri ed efficaci per genico in vivo , l’analisi completa di funzione del gene di zanzara è richiesto.

Microiniezione diretta del plasmide DNA, doppio incagliato RNA (dsRNA) o short interfering RNA (siRNA) è il più comunemente usato in vivo gene consegna metodo nelle zanzare. Infatti, la produzione di ceppi transgenici di zanzare ancora contare su un processo di embrione microiniezione^5,6,7. Tuttavia, la microiniezione presenta diverse limitazioni. In primo luogo, questa tecnica è tecnicamente impegnativo e comporta procedure complicate. In secondo luogo, iniezione provoca un insulto fisico per l’embrione, larve, pupe e adulto, che colpisce direttamente la vitalità dell’organismo bersaglio. In terzo luogo, è difficile immobilizzare le larve di zanzara per il microinjection perché la maggior parte vivono in un habitat acquatico e possiedono una caratteristica guizzante di movimento. In quarto luogo, la dimensione di 1^st-2^nd instar larve è 10 – 20 volte più piccola di quella di 4^th instar e larve di età superiore e le cuticole dell’ex sono più delicate. Queste caratteristiche lo rendono difficile da manipolare 1^st-2^nd instar larve rispetto a quelli nelle fasi precedenti. Combinati, questi fattori contribuiscono a un tasso di sopravvivenza riduttore post-iniezione per le larve (5% circa) rispetto a adulti⁸. Sistemi di consegna basati su virale sono stati sviluppati per superare le barriere extracellulari ed intracellulari associate. Questi sistemi presentano i vantaggi di facile manipolazione, efficienza di trasduzione alta, robusti e a lungo termine i livelli di espressione e la capacità di produrre gli effetti persistenti in vivo. Di conseguenza, gene consegna sistemi che utilizzano retrovirus, lentivirus e gli adenovirus sono stati ampiamente usato linee cellulari inmammalian e specie modello. Il sistema di espressione virale Sindbis era stato precedentemente utilizzato per analizzare la funzione genica nella zanzara adulta; oltre le preoccupazioni di sicurezza biologica, tuttavia, l’iniezione è ancora un processo necessario per infezione virale⁹. Anche se, la consegna orale impregnando le larve nella soluzione dsRNA è stata segnalata precedentemente come un metodo di consegna fattibile, è inadatto per piccoli RNA funzione analisi¹⁰. Così, metodi di consegna virale efficace ancora devono essere sviluppati per le zanzare.

Zanzara densoviruses (MDVs) fanno parte della sottofamiglia Densovirinae dei Parvoviridaee tutti, ma una caduta all’interno del genere Brevidensovirus¹¹. I virions MDV sono senza involucro e sono costituiti da un singola elica (ssDNA) genoma e un capside icosaedrica (20 nm di diametro). Il genoma virale è di circa 4 kb e viene replicato all’interno dei nuclei delle cellule dell’ospite. MDVs sono relativamente stabili nell’ambiente e mostrare una gamma stretta host con alta specificità per le zanzare. Questi virus hanno il potenziale per diffondere e mantenere naturalmente nelle popolazioni di zanzare e possono invadere quasi tutti gli organi e tessuti di questi insetti, tra cui del midgut, tubuli malpighiani, corpo grasso, muscolatura, neuroni e ghiandole salivarie¹².

Genomi MDV intatti possono subclonati in vettori plasmidici per produrre cloni infettivi basati su plasmide; Quando questi cloni sono trasportati nelle cellule della zanzara, il genoma virale viene estratta dal vettore plasmidico e particelle virali infettive sono prodotte. Perché MDV ha un genoma di piccole ssDNA, cloni infettivi sono facilmente costruiti e il genoma virale può essere facilmente manipolabile^11,13. Queste caratteristiche rendono MDV un agente importante per l’esame di biologia della zanzara. Tuttavia, poiché quasi tutti della sequenza del genoma virale è essenziale per la proliferazione virale, la creazione di virus ricombinante attraverso la sostituzione o l’inserimento di geni estranei comporta una perdita nella capacità di imballaggio e/o replica virale, che crea un barriera per lo sviluppo di MDVs come vettori di consegna del gene. Qui, segnaliamo che usando una strategia artificiale intronic piccolo-RNA espressione per sviluppare un rAaeDV non difettosi in vivo RNA delivery system che ha i vantaggi della costruzione del plasmide facile e la manutenzione di un virus funzionale che può produrre stabile e a lungo termine l’espressione in cellule di host senza la necessità di virus wild-type. Inoltre, questo metodo consente la facile trasduzione delle larve.

In questo studio vengono descritti i protocolli per le fasi successive: linea 1) progetto di rAaeDVs codifica una cassetta di espressione di piccolo-RNA intronic, 2) produzione di particelle di virus ricombinante mediante la cella di imballaggio C6/36, 3) analisi quantitativa di cella-free rAaeDV genoma copiare numeri e 4) infezione delle larve di Ae. albopictus per introduzione diretta del virus nel corpo dell’acqua dell’habitat larvale. Nel complesso, questo lavoro ha dimostrato che piccole molecole di RNA specifici o geni bersaglio possono essere iperespresso o abbattuti in larve di zanzara utilizzando il sistema di consegna MDV sviluppato.