Imaging Live di Mouse Seconda Palate Fusion

La fusione tissutale è un passo importante nello sviluppo di organi multipli. I principali difetti della nascita umana, quali il labbro e il palato, la bifida delle spine e le malformazioni del cuore possono derivare da difetti nella fusione tissutale ¹ . La fusione del palato secondario del mouse è stata ampiamente studiata per identificare i meccanismi cellulari e molecolari che controllano la fusione tissutale nello sviluppo ^{2 , 3 , 4} . Nel topo, lo sviluppo del palato secondario inizia a circa E11.5 con l'espansione di un ripiano secondario palatale da ognuno dei processi bilaterali maxillari. La crescita iniziale degli scaffali palatali si verifica verticalmente lungo la lingua, fino a circa l'E14.0, durante i quali gli scaffali palatari si elevano orizzontalmente sopra la lingua. La crescita medialmente diretta produce un contatto fisico tra l'epiteli apposita dei due ripiani palatari, formando l'epitelio della medianaAl seam (MES) a E14.5. Il MES interveniente deve essere rimosso tra gli scaffali palatali secondari per consentire la confluenza mesenchimale e lo sviluppo di un palato secondario intatto, completamente fuso, da E15.5 ³ .

Come uno strato di cellule MES epiteliale condiviso tra due mensole palatine separate e poi rimosso per ottenere confluenza mesenchimale, è stata una questione centrale nello sviluppo del palato. Sulla base di studi sul microscopio istologico e elettronico del microscopio (EM), sugli studi sulla cultura esplosiva e sugli esperimenti funzionali di genetica del mouse, sono stati implicati diversi comportamenti di cellule fondamentali in questo processo. Le proiezioni simili a filopodie dall'epitelio mediale del bordo MEE di ogni mensola palatina facilitano il contatto iniziale ^{5 , 6} , seguito da intercalazione di queste cellule epiteliali a un singolo MES ^{6 , 7} condiviso. Rimozione della conseguente MES condivisaÈ stato proposto di procedere con tre meccanismi non esclusivi. Gli studi iniziali che impiegavano osservazioni istologiche e tracciamento lineare ex vivo con coloranti vitali indicavano che la MES potrebbe essere rimossa dall'epitelio alla transizione mesenchimale (EMT) delle cellule MES ^{8 , 9} , anche se più recentemente il tracciamento genetico delle cellule epiteliali ha aumentato l'incertezza Il contributo a lungo termine delle cellule epiteliali al mesenchimico palatale ^{10 , 11 , 12} . Un numero significativo di cellule apoptotiche e una riduzione del loro numero in alcuni mutanti che non subiscono una corretta fusione di palato hanno portato all'idea che l'apoptosi può essere un fattore importante della dissoluzione MES ^{2 , 3} . Infine, basata inizialmente su studi che coinvolgono l'etichettatura epiteliale e l'osservazione statica a tempi progressivi, le cellule MESSono stati proposti di migrare nelle dimensioni oronasali e anteroposterior ^{11 , 13} , ma tali comportamenti dinamici di cellule sono stati inizialmente non confermati a causa di una incapacità di osservarli nel tessuto palatale vivo. Recentemente siamo stati in grado di osservare direttamente questi comportamenti sviluppando una nuova metodologia di imaging dal vivo che combina i metodi genetici del mouse con l'etichettatura fluorescente con l'imaging live in confocale di scaffali palatali esplorati.

In primo luogo, per visualizzare i comportamenti cellulari dinamici nelle cellule epiteliali del palato durante la fusione del palato, abbiamo generato un mouse reporter specifico epiteliale attraversando i topi ^flox ROSA26-mTmG con i topi Keratin ¹⁴ -cre ^{14 , 15} . L'imaging in diretta confocale della cultura esplante del palato degli embrioni risultanti ha confermato alcuni comportamenti cellulari proposti in precedenza e ha identificato nuovi eventi nel processo di fusione ⁶ </sup>. Le protuberanze della membrana delle cellule epiteliali hanno preceduto il contatto cellulare iniziale seguito da convergenza epiteliale mediante intercalazione delle cellule e spostamento delle cellule oronasali. Notevolmente, abbiamo anche scoperto che l'estrusione cellulare, un processo segnalato per svolgere ruoli importanti nell'omeostasi epiteliale, è stato un meccanismo importante che porta la fusione dei palati secondari del mouse ^{6 , 16} . Questo metodo di imaging può essere utilizzato con altre linee di reporter; Abbiamo utilizzato i topi transgenici Lifeact-mRFPruby ^{17 , 18} per esaminare le dinamiche citoscheletriche dell'atina durante il processo di fusione. Altri giornalisti possono anche essere impiegati per osservare altri aspetti specifici della fusione di palato e questo metodo può essere adattato sia alla microscopia confocale a scansione laser che alla microscopia confocale del disco di filatura, a seconda delle esigenze di imaging e della disponibilità del microscopio. L'imaging in diretta sta diventando sempre più un approccio fondamentale nella biologia dello sviluppo. PartiLa morfogenesi craniofacialica è complessa e le difese di nascita umane che colpiscono il viso sono comuni. Questo metodo di imaging live in confocale aiuterà a consentire una migliore comprensione dei meccanismi fondamentali di sviluppo fondamentali e delle origini delle anomalie craniofacciali umane.