Alimentación dieta alta en grasas y alto rendimiento Triacylglyceride ensayo en Drosophila Melanogaster
Summary
Se trata de una dieta alta en grasas alimentación protocolo para inducir obesidad en Drosophila, un modelo de mecanismos moleculares fundamentales comprensión implicados en la lipotoxicidad. También proporciona un análisis de alto rendimiento triacylglyceride para medir la acumulación de grasa en Drosophila y potencialmente otros modelos (insectos) en diversas condiciones de dieta, ambientales, genéticas o fisiológicas.
Abstract
Enfermedad cardíaca es la causa número una de muerte humana en todo el mundo. Numerosos estudios han demostrado fuertes conexiones entre la obesidad y fallo cardíaco en los seres humanos, pero se necesitan más herramientas y esfuerzos de investigación para dilucidar mejor los mecanismos implicados. Para más de un siglo, el modelo genético altamente manejable de Drosophila ha sido fundamental en el descubrimiento de genes clave y vías moleculares que demostró ser altamente conservadas entre especies. Muchos procesos biológicos y mecanismos de la enfermedad se conservan funcionalmente en la marcha, como el desarrollo (p. ej., plan de cuerpo, corazón), cáncer y enfermedades neurodegenerativas. Recientemente, el estudio de la obesidad y patologías secundarias, tales como enfermedades del corazón en organismos modelo, ha desempeñado un papel muy importante en la identificación de los principales reguladores implicados en el síndrome metabólico en los seres humanos.
Aquí, nos proponemos utilizar este organismo modelo como una herramienta eficaz para inducir la obesidad, es decir, la acumulación excesiva de grasa y desarrollar un protocolo eficiente para monitorear el contenido de grasa en forma de acumulación de TAGs. Además de altamente conservado, pero menos complejo genoma, la mosca también tiene una vida útil corta para la experimentación rápida, combinada con la rentabilidad. Este documento proporciona un protocolo detallado para la alimentación de la dieta de grasa alto (HFD) en Drosophila para inducir a la obesidad y un análisis de alto rendimiento triacylglyceride (etiqueta) para medir el aumento asociado en contenido de grasa, con el objetivo de ser altamente reproducibles y eficiente para la detección genética o química a gran escala. Estos protocolos ofrecen nuevas oportunidades para eficiente investigar mecanismos regulatorios involucrados en la obesidad, así como proporcionar una plataforma estandarizada para la investigación de descubrimiento de drogas para la prueba rápida del efecto de fármacos candidatos en el desarrollo o prevención de la obesidad, diabetes y enfermedades metabólicas relacionadas.
Introduction
Estamos en un momento donde la obesidad y sus cargas económicas asociadas, es un problema mundial1. Dos de cada tres estadounidenses tienen sobrepeso u obesidad con cardiopatías relacionadas, la principal causa de muerte en la población adulta de2. Se necesitan nuevos métodos eficientes para investigar adecuadamente los componentes genéticos y moleculares implicados en la regulación del síndrome metabólico utilizando organismos modelo. Por esta razón, elegimos el modelo de Drosophila mosca de la fruta porque comparte los procesos biológicos más básicos con los mamíferos, como ratones y seres humanos3,4,5,6. Genoma de drosophilaes altamente conservados durante la evolución, pero en general mucho más pequeña con menos duplicación del gene y complejidad metabólica, lo que es ideal para la comprensión de los mecanismos fundamentales implicados en muchas enfermedades humanas4 , 7 , 8. Asimismo, procesos característicos realizados por el tejido adiposo, intestino y páncreas están representados en la marcha y mediar funciones reguladoras en el metabolismo de glucosa y de lípido, por ejemplo, que son similares a los seres humanos9, 10,11. Por otra parte, las vías moleculares básicas implicados en el control de la obesidad, resistencia a la insulina y la diabetes en los seres humanos son funcionalmente conservadas en Drosophila melanogaster12,13,14 , 15 , 16. como organismos superiores, Drosophila tiene un corazón que se forma durante el desarrollo de procesos similares a la de los mamíferos corazón3,17. Así, el desarrollo de un confiable HFD alimentación protocolo y ensayo de etiqueta de alto rendimiento, adaptado para los propósitos de la investigación eficiente utilizando la caja de herramientas genética de Drosophila, proporcionan un medio importante para estudiar y comprender la base genética fundamental subyacente a enfermedades metabólicas complejas.
La comida HFD sí mismo se hace de un alimento mosca de laboratorio estándar suplementado con aceite de coco, que se compone principalmente de ácidos grasos saturados sabidos para ser asociado con síndrome metabólico18. Mientras que inducir obesidad en modelos de mamíferos, como roedores, puede tomar meses19,20, nuestro HFD optimizado protocolo de alimentación en Drosophila efectiva y reproducible aumenta la grasa en cuestión de días12,14. Este protocolo, junto con un análisis de alto rendimiento etiqueta, permite la investigación total eficaz para los efectos de factores genéticos, influencias ambientales y los candidatos de la droga para descubrir nuevos moduladores del metabolismo de las grasas. En consecuencia, estos protocolos son probablemente relevantes para entender y combatir la obesidad y patologías humanas asociadas a la obesidad.
El protocolo de alimentación es versátil y se puede aplicar para estudiar los efectos metabólicos y funcionales de solo ácidos de grasos saturados o insaturados. El uso de este análisis de etiquetas de alto rendimiento no se limita a la D. melanogaster, pero puede ser adaptado a una variedad de organismos modelo pequeño con cutícula o matrices extracelulares difíciles (p. ej., otras especies de Drosophila , C. elegans y otros organismos invertebrados modelo) para medir el contenido de grasa en diferentes condiciones ambientales, genéticas o fisiológicas, en cualquier etapa del desarrollo, la adultez o fase de enfermedad metabólica. El ensayo de la etiqueta se basa en una medición colorimétrica de una serie de reacciones enzimáticas que degradan las etiquetas en ácidos grasos libres, glicerol glicerol 3-fosfato y finalmente H2O2 reacciona con 4-aminoantipirina (4-AAP) y 3,5- Dicloro-2-hidroxibenceno sulfonato (DHBS 3,5) para producir un producto de color rojo que se mide mediante un espectrofotómetro de 96 pocillos.
Protocol
Representative Results
Discussion
La inducción de la obesidad en ratones puede tomar meses19,20. En moscas, este HFD protocolo de alimentación permite la inducción de la excesiva acumulación de grasa en cuestión de días o menos, causando aumento en la acumulación de grasa solamente después de 18 h (ver figura 2). HFD de alimentación con el protocolo descrito aumenta glucosa contenido 12 y disminuye Bmm lipasa y de la expresi?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a Erika Taylor para la edición de este manuscrito. Este trabajo fue financiado por subvenciones de los institutos nacionales de salud (P01 HL098053, P01 AG033561 y HL054732 R01) a R.B., un suplemento de investigación post-doctoral (R01 HL085481) y compañerismo (AAUW) a S.B.D. y becas de la American Heart Association a S.B.D. y R.T.B.
Materials
| Talboys Ball dropper/bead Dispenser | Talboys | #: 930150 | |
| Talboys High Throughput Homogenizer | Talboys | #: 930145 | |
| Grinding Balls, Stainless Steel | OPS Diagnostics, LLC | # GBSS 156-5000-01 | 5000 balls |
| Masterblock 96 Well deep Microplates | Greiner Bio-One | # T-3058-1 | case of 80 plates |
| Greiner 96 well microplate flat bottom | Sigma Aldrich | # M4436 | 40 plates |
| Greiner CapMat for sealing multiwell plates | Sigma Aldrich | # C3606 | 50 sealing plates |
| Reagent Reservoirs | Thomas Scientific | # 1192T71 | 12/PK |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661040 | Thermo Scientific | # 4661040 | 1-10 ul multipipette |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661070 | Thermo Scientific | # 4661070 | 30-300ul multipipette |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661020 | Thermo Scientific | #4661020 | 10-100ul multipipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | # P3131-S | for 10 uL pipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | # P3133-S | for 200 uL pipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | #P1125 | for 100 uL pipette |
| Forceps | Roboz Surgical | # 5 Dumonts | Super fine forceps |
| Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64 | Cole-Parmer scientific experts | # EW-11333-00 | |
| Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance | Cole-Parmer scientific experts | # EW-11333-49 | |
| 96-Well microplate Centrifuge | Hettich Zentrifugen | # Rotina 420R | |
| Microplate Reader | Molecular devices | # SpectraMax 190 | |
| Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator | Biostad | # 3527 | |
| Infinity Triglycerides reagent | Thermo Scientific | # TR22421 | |
| Triglyceride Standard | Stanbio | #2103 – 030 | |
| Quick Start Bradford Protein Assay | Bio-RAD | # 500-0205 | 1x dye Reagent |
| Coconut oil | Nutiva | # 692752200014 | 15 0z jar |
| PBS 10X | Thermo Scientific | # AM9625 | 500 ml |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | # 9002-93-1 | |
| Gas-permeable Foil | Macherey-Nagel | # 740675 | 50 pieces |
| filter Paper | VWR | # 28317-241 | Pack of 100 |
| Drosophila vials | Genesee Scientific | Cat #: 32-116SB | |
| Quick Start Bovine Serum Albumin Standard | Bio-Rad | # 5000206 | |
| FlyNap Anesthetic | Carolina | # 173025 | 100 mL |
| Kimwipes Low-Lint | Uline | # S-8115 | 1-Ply, 4.4 x 8.4" |
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