Summary

Alimentation de régime riche en graisses et haut débit triacylglycérides essai chez Drosophila Melanogaster

Published: September 13, 2017
doi:

Summary

Il s’agit d’un régime riche en graisses alimentation protocole pour provoquer l’obésité chez la drosophile, un modèle pour la compréhension des mécanismes moléculaires fondamentaux impliqués dans la lipotoxicité. Il fournit également un dosage de triacylglycérides à haut rendement pour mesurer l’accumulation de graisse dans la drosophile et potentiellement d’autres modèles (insectes) dans diverses conditions alimentaires, environnementale, génétiques ou physiologiques.

Abstract

Maladie cardiaque est la première cause de mortalité humaine dans le monde. Nombreuses études ont montré des liens solides entre l’obésité et de défaillance cardiaque chez les humains, mais plus d’outils et les efforts de recherche sont nécessaires pour mieux élucider les mécanismes impliqués. Pour plus d’un siècle, le modèle génétiquement très docile de la drosophile a contribué à la découverte de gènes clés et les voies moléculaires qui s’est avéré être hautement conservée à travers les espèces. De nombreux processus biologiques et les mécanismes de la maladie sont fonctionnellement conservées chez la mouche, tels que le développement (par exemple, plan du corps, coeur), le cancer et les maladies neurodégénératives. Récemment, l’étude de l’obésité et des pathologies secondaires, tels que les maladies cardiaques chez les organismes modèles, a joué un rôle critique dans l’identification des régulateurs clés impliqués dans le syndrome métabolique chez l’homme.

Ici, nous vous proposons d’utiliser cet organisme modèle comme un outil efficace pour induire l’obésité, par exemple, l’accumulation excessive de graisse et élaboration d’un protocole efficace pour surveiller la teneur en matière grasse sous la forme de l’accumulation de TAGs. Outre le hautement conservée, mais moins complex génome, la mouche a également une durée de vie courte pour une expérimentation rapide, combinée à la rentabilité. Ce document fournit un protocole détaillé pour haute graisse Diet (HFD) alimentation chez la drosophile pour provoquer l’obésité et un dosage de triacylglycérides (TAG) à haut débit pour mesurer l’augmentation connexe de la teneur en matière grasse, dans le but d’être hautement reproductible et efficace pour le dépistage génétique ou chimique à grande échelle. Ces protocoles offrent de nouvelles opportunités pour efficacement enquêter sur les mécanismes de régulation impliquées dans l’obésité, ainsi que fournir une plate-forme standardisée pour recherche de découverte de médicaments pour le test rapide de l’effet de médicaments potentiels sur le développement ou prévention de l’obésité, le diabète et les maladies métaboliques associées.

Introduction

Nous sommes dans un moment où l’obésité et ses contraintes économiques associés, est un problème mondial1. Deux de chaque trois Américains sont en surpoids ou obèses présentant des pathologies cardiaques connexes, la principale cause de décès au sein de la population adulte2. Nouvelles méthodes efficaces sont nécessaires pour enquêter adéquatement sur les composantes génétiques et moléculaires impliqués dans la régulation du syndrome métabolique à l’aide d’organismes modèles. Pour cette raison, nous choisissons la drosophile Drosophila modèle parce qu’elle partage les processus biologiques élémentaires avec les mammifères, y compris les souris et les humains3,4,5,6. Génome de la drosophileest hautement conservée au cours de l’évolution, mais dans l’ensemble beaucoup plus petites avec moins de duplication génique et complexité métabolique, ce qui est idéal pour la compréhension des mécanismes fondamentaux impliqués dans plusieurs maladies humaines4 , 7 , 8. en outre, caractéristique des processus effectué par le tissu adipeux, le tube digestif et pancréas sont représentés à la volée et médiation des fonctions de régulation dans le métabolisme de glucose et des lipides, par exemple, qui sont semblables aux êtres humains9, 10,11. En outre, les base voies moléculaires impliquées dans le contrôle de l’obésité, résistance à l’insuline et le diabète chez l’humain sont fonctionnellement conservés Drosophila melanogaster12,13,14 , 15 , 16. comme les organismes supérieurs, Drosophila a un cœur qui bat qui est formé au cours du développement par un processus similaire à celui des mammifères coeur3,17. Ainsi, le développement d’un SIH fiable alimentant le protocole et le dosage de TAG à haut débit, adaptés à des fins de dépistage efficace à l’aide de la boîte à outils génétiques de la drosophile, constituent un moyen important d’étudier et de comprendre les bases génétiques fondamentales maladies métaboliques complexes sous-jacentes.

La nourriture HFD lui-même est issue d’un aliment de mouche de laboratoire standard additionné d’huile de coco, qui est composée principalement d’acides gras saturés, connus pour être associés avec le syndrome métabolique18. Induisant l’obésité chez les modèles mammifères, tels que les rongeurs, peut prendre des mois19,20, notre HFD optimisé, protocole d’alimentation chez la drosophile efficacement et de façon reproductible augmente organismique de matière grasse dans une affaire de jours12,14. Ce protocole, en conjonction avec un essai de débit élevé TAG, permet le dépistage de masse efficace pour les effets de facteurs génétiques, les influences de l’environnement et les médicaments candidats à découvrir de nouveaux modulateurs du métabolisme des graisses. En conséquence, ces protocoles sont probables pertinents pour comprendre et combattre l’obésité et les pathologies humaines associées à l’obésité.

Le protocole alimentaire est polyvalent et peut être appliqué à l’étude les effets métaboliques et fonctionnelles du seul des acide gras saturé ou insaturé. L’utilisation de ce test de TAG à haut débit n’est pas limitée à d. melanogaster, mais peut être adaptée à une variété d’organismes petit modèle avec cuticule ou difficiles matrices extracellulaires (p. ex., autres espèces de drosophile , c. elegans et les autres nouveaux organismes invertébrés modèles) pour mesurer la teneur en matières grasses dans différentes conditions environnementales, génétiques ou physiologiques, à tout stade de développement, à l’âge adulte ou phase de maladie métabolique. Le TAG est basé sur une mesure colorimétrique d’une série de réactions enzymatiques qui dégradent les balises en acides gras, le glycérol, le glycérol 3-phosphate et enfin H2O2 qui réagit avec l’amino-4 antipyrine (4-AAP) et 3,5- dichloro-2-hydroxybenzène sulfonate (DHBS 3,5) pour produire un produit de couleur rouge qui est mesuré à l’aide d’un spectrophotomètre de 96 puits.

Protocol

1. HFD, protocole d’alimentation tableau 1. Recette de nourriture volée. Ce tableau résume les différents ingrédients utilisés pour préparer notre contrôle alimentaire. Une fois fait, 10 mL de l’aliment est versé dans les fioles, refroidi et stocké à 4 ° C pour un stockage prolongé. Préparation HFD pour faire 1 kg de matières grasses alimentair…

Representative Results

Chez d. melanogaster, comme c’est le cas avec d’autres espèces, il y un dimorphisme sexuel entre mâles et femelles22. Il est bien connu que les femelles sont plus grandes, avec plus de gras dans leur abdomen, que les hommes22. Pour tester l’efficacité de notre protocole, nous avons effectué TAG tests afin de déterminer les différences dans le contenu de la balise entre mâles et femelles de laboratoire standard type sauv…

Discussion

Induction de l’obésité chez la souris peut prendre des mois19,20. Chez les mouches, ce HFD, protocole d’alimentation permet d’induction de l’accumulation de graisse excédentaire dans une affaire de jours ou moins, entraînant des augmentations dans l’accumulation de graisse seulement après 18 h (voir Figure 2). HFD alimentation avec le protocole décrit augmente le glucose contenu 12 et diminue l…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier Erika Taylor pour l’édition de ce manuscrit. Ce travail a été financé par des subventions accordées par le National Institutes of Health (P01 HL098053, P01 AG033561 et HL054732 R01) à R.B., un supplément de recherche postdoctorale (R01 HL085481) et la bourse (AAUW) à S.B.D. et aux dons de l’American Heart Association à S.B.D. et R.T.B.

Materials

Talboys Ball dropper/bead Dispenser Talboys #: 930150
Talboys High Throughput Homogenizer Talboys #: 930145
Grinding Balls, Stainless Steel  OPS Diagnostics, LLC # GBSS 156-5000-01 5000 balls
Masterblock 96 Well deep Microplates Greiner Bio-One # T-3058-1 case of 80 plates
Greiner  96 well microplate flat bottom Sigma Aldrich # M4436 40 plates
Greiner CapMat for sealing multiwell plates Sigma Aldrich # C3606 50 sealing plates
Reagent Reservoirs  Thomas Scientific # 1192T71 12/PK
Thermo Scientific Finnpipette 4661040 Thermo Scientific # 4661040 1-10 ul multipipette
Thermo Scientific Finnpipette 4661070 Thermo Scientific # 4661070 30-300ul multipipette
Thermo Scientific Finnpipette 4661020 Thermo Scientific #4661020 10-100ul multipipette
Multichannel tips Denville Scientific Inc # P3131-S for 10 uL pipette
Multichannel tips Denville Scientific Inc # P3133-S for 200 uL pipette
Multichannel tips Denville Scientific Inc #P1125 for 100 uL pipette
Forceps  Roboz Surgical # 5 Dumonts Super fine forceps
Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64 Cole-Parmer scientific experts # EW-11333-00
Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance Cole-Parmer scientific experts # EW-11333-49
96-Well microplate Centrifuge Hettich Zentrifugen # Rotina 420R
Microplate Reader Molecular devices # SpectraMax 190
Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator Biostad # 3527
Infinity Triglycerides reagent Thermo Scientific # TR22421
Triglyceride Standard Stanbio #2103 – 030
Quick Start Bradford Protein Assay Bio-RAD # 500-0205 1x dye Reagent
Coconut oil Nutiva # 692752200014 15 0z jar
PBS 10X Thermo Scientific # AM9625 500 ml
Triton X-100 Sigma Aldrich # 9002-93-1
Gas-permeable Foil Macherey-Nagel # 740675 50 pieces
filter Paper VWR # 28317-241 Pack of 100
Drosophila vials Genesee Scientific Cat #: 32-116SB
Quick Start Bovine Serum Albumin Standard Bio-Rad # 5000206
FlyNap Anesthetic Carolina # 173025 100 mL
Kimwipes Low-Lint Uline # S-8115 1-Ply, 4.4 x 8.4"

References

  1. Ng, M., et al. Global, regional, and national prevalence of overweight and obesity in children and adults during 1980-2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013. Lancet. 384, 766-781 (2014).
  2. Mortality in the United States, 2014. NCHS data brief, no 229 Available from: https://www.cdc.gov/nchs/products/databriefs/db229.htm (2015)
  3. Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends Cardiovasc Med. 5, 21-28 (1995).
  4. Brumby, A. M., Richardson, H. E. Using Drosophila melanogaster to map human cancer pathways. Nat Rev Cancer. 5, 626-639 (2005).
  5. Chan, H. Y., Bonini, N. M. Drosophila models of human neurodegenerative disease. Cell Death Differ. 7, 1075-1080 (2000).
  6. Levine, M., et al. Human DNA sequences homologous to a protein coding region conserved between homeotic genes of Drosophila. Cell. 38, 667-673 (1984).
  7. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).
  8. Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342, 1-11 (2004).
  9. Noyes, B. E., et al. Identification and expression of the Drosophila adipokinetic hormone gene. Mol Cell Endocrinol. 109, 133-141 (1995).
  10. Rajan, A., Perrimon, N. Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies. BMC Biol. 11, 38 (2013).
  11. Rulifson, E. J., et al. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296, 1118-1120 (2002).
  12. Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12, 533-544 (2010).
  13. Musselman, L. P., et al. A high-sugar diet produces obesity and insulin resistance in wild-type Drosophila. Dis Models Mech. 4, 842-849 (2011).
  14. Diop, S. B., Bodmer, R. Gaining Insights into Diabetic Cardiomyopathy from Drosophila. Trends Endocrinol Metab. 26, 618-627 (2015).
  15. Williams, M. J., et al. The Obesity-Linked Gene Nudt3 Drosophila Homolog Aps Is Associated With Insulin Signaling. Mol Endocrinol. 29, 1303-1319 (2015).
  16. Morris, S. N., et al. Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster. Biochim Biophys Acta. 1822, 1230-1237 (2012).
  17. Bodmer, R. The gene tinman is required for specification of the heart and visceral muscles in Drosophila. Development. 118, 719-729 (1993).
  18. Erkkila, A., et al. Dietary fatty acids and cardiovascular disease: an epidemiological approach. Prog Lipid Res. 47, 172-187 (2008).
  19. Ganz, M., et al. High fat diet feeding results in gender specific steatohepatitis and inflammasome activation. World J Gastroenterol. 20, 8525-8534 (2014).
  20. Wang, C. Y., Liao, J. K. A mouse model of diet-induced obesity and insulin resistance. Methods Mol Biol. 821, 421-433 (2012).
  21. Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods Mol Biol. 420, 27-44 (2008).
  22. Mathews, K. W., et al. Sexual Dimorphism of Body Size Is Controlled by Dosage of the X-Chromosomal Gene Myc and by the Sex-Determining Gene tra in Drosophila. 遗传学. 205, 1215-1228 (2017).
  23. Golay, A., Bobbioni, E. The role of dietary fat in obesity. Int J Obes Relat Metab Disord. 21, 2-11 (1997).
  24. Diop, S. B., et al. PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase. Cell Rep. 10, 1-13 (2015).
  25. Chatterjee, D., et al. Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 17959-17964 (2014).
  26. Palanker, L., et al. Drosophila HNF4 regulates lipid mobilization and beta-oxidation. Cell Metab. 9, 228-239 (2009).
  27. Heinrichsen, E. T., Haddad, G. G. Role of high-fat diet in stress response of Drosophila. PLoS One. 7, 42587 (2012).
  28. Kitahara, C. M., et al. Association between class III obesity (BMI of 40-59 kg/m2) and mortality: a pooled analysis of 20 prospective studies. PLoS Med. 11, 1001673 (2014).
  29. Reis, A., et al. A comparison of five lipid extraction solvent systems for lipidomic studies of human LDL. J Lipid Res. 54, 1812-1824 (2013).
  30. Turne, C., et al. Supercritical fluid extraction and chromatography for fat-soluble vitamin analysis. J Chromatogr A. 936, 215-237 (2001).
  31. Na, J., et al. Drosophila model of high sugar diet-induced cardiomyopathy. PLoS Genet. 9, 1003175 (2013).

Play Video

Cite This Article
Diop, S. B., Birse, R. T., Bodmer, R. High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (127), e56029, doi:10.3791/56029 (2017).

View Video