ARNm Interactome Captura de Planta Protoplastos

Los eucariotas utilizan múltiples vías reguladoras de la biogénesis del ARN para mantener los procesos biológicos celulares. Entre los tipos conocidos de ARN, el ARNm es muy diverso y lleva la capacidad de codificación de las proteínas y sus isoformas ^1. La ruta PTGR dirige los destinos de los pre-mRNAs ^{2 , 3} . RBPs de diferentes familias de genes controlan la regulación de ARN, y en PTGR, mRBPs específicos guían mRNAs a través de interacciones físicas directas, formando mRNPs funcional. Por lo tanto, la identificación y caracterización de mRBPs y sus mRNPs es fundamental para entender la regulación del metabolismo del mRNA celular ^2. Durante las últimas tres décadas, varios métodos in vitro – incluyendo los ensayos de desplazamiento de movilidad electroforética de ARN (REMSA), evolución sistemática de ligandos mediante ensayos de enriquecimiento exponencial (SELEX) basado en constructos derivados de la biblioteca, RNA Bind-n-Seq (RBNS), radiomarcado o cuantitativoEnsayos de unión a ARN de fluorescencia, cristalografía de rayos X y espectroscopia de RMN ^{4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9} – se han aplicado ampliamente a estudios de RBP, principalmente a partir de células de mamífero. Los resultados de estos estudios de mamíferos RBPs se puede buscar a través de la RNA-binding Protein DataBase (RBPDB), que recoge las observaciones publicadas [ ^10] .

Aunque estos enfoques in vitro son herramientas de gran alcance, que determinan los motivos de ARN unido de un determinado grupo de RNA de secuencias y por lo tanto, están limitados en su capacidad para descubrir nuevos ARN objetivo. Lo mismo es cierto para las estrategias computacionales para predecir el genoma de todo RBPs, que se basan en la conservación de la secuencia de proteínas y la estructura [ ^15] . Para superar esto, un nuevo método experimental haSe ha establecido que permite la identificación de los motivos de ARN que un RBP de interés interactúa con, así como para la determinación de la ubicación precisa de la unión. Este método, denominado "reticulación e inmunoprecipitación" (CLIP), está compuesto de reticulación UV in vivo seguida por inmunoprecipitación ¹¹ . Los primeros estudios han demostrado que la fotoactivación de nucleótidos de ADN y ARN puede ocurrir a una longitud de onda UV de excitación mayor que 245 nm. La reacción a través de la timidina parece ser favorecida (rango en orden de disminución de la fotoreactividad: dT ≥ dC> rU> rC, dA, dG) ¹² . Usando luz UV con una longitud de onda de 254 nm (UV-C), se observó que se crean enlaces covalentes entre nucleótidos de ARN y residuos de proteína cuando están en el rango de sólo unos pocos Angstroms (Å). Por lo tanto, el fenómeno se denomina reticulación de "cero longitud" de RNA y RBP. Esto puede ser seguido por un procedimiento de purificación estricto Con poco fondo ^{13 , 14} .

Una estrategia complementaria al CLIP consiste en combinar la reticulación UV in vivo con la identificación de proteínas para describir el paisaje de las RBP. Se han aislado varios proteomas unidos a mRNA de este genoma de células de levadura, células madre embrionarias (ESCs) y líneas celulares humanas ( es decir, HEK293 y HeLa) usando este nuevo enfoque experimental, denominado "captura de interactomas de mRNA" ^{18 , 19 , 20 , 21} . El método se compone de reticulación UV in vivo seguida por purificación de mRNP y proteómica basada en MS. Mediante la aplicación de esta estrategia, se han descubierto muchas RBP no lineales que contienen RBDs no canónicos y se ha puesto de manifiesto que más proteínas tienen capacidades de unión a ARN de lo que se suponía anteriormente"> ^{15, 16, 17.} El uso de este método permite nuevas aplicaciones y para la capacidad de responder a las nuevas preguntas biológicos en la investigación de las prácticas comerciales restrictivas. Por ejemplo, un estudio reciente ha investigado la conservación del proteoma ARNm unido (el núcleo RBP Proteoma) entre la levadura y las células humanas [ ^22] .

Se ha descubierto que las RBP de las plantas están implicadas en el crecimiento y desarrollo ( por ejemplo , en la regulación post-transcripcional del tiempo de floración, el reloj circadiano y la expresión génica en mitocondrias y cloroplastos) ^{24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29} . Además, se piensa que desempeñan funciones en los procesos celulares que responden a tensiones abióticas ( por ejemplo, frío, sequía, saLinidad y ácido abscísico (ABA)) ^{31 , 32 , 33 , 34} . Existen más de 200 genes RBP predichos en el genoma de Arabidopsis thaliana , basados ​​en motivos de secuencia de dominio de reconocimiento de ARN (RRM) y homología K (KH); En el arroz, aproximadamente 250 se han observado ^{35 , 36} . Es notable que muchos RBPs predicho parecen ser únicos a las plantas ( por ejemplo, ningún orthologs del metazoan a aproximadamente el 50% de RBP predichas de Arabidopsis que contienen un dominio de RRM) ³⁵ , sugiriendo que muchos pueden servir a nuevas funciones. Las funciones de la mayoría de las RBP predicho siguen sin caracterizar [ ^23] .

El aislamiento de proteomas unidos a ARNm de plántulas etioladas de Arabidopsis , tejido foliar, células de raíces cultivadas y protoplastos de mesofilo de hoja mediante el uso deMRNA interactome captura se ha informado recientemente ^{38 , 39} . Estos estudios demuestran el fuerte potencial de catalogar sistemáticamente las RBP funcionales en las plantas en un futuro próximo. Aquí, presentamos un protocolo para mRNA interactome captura de protoplastos de plantas ( es decir, células sin paredes celulares). Los protoplastos de mesofila de la hoja de Arabidopsis thaliana son el tipo principal de células foliares. Los protoplastos aislados permiten el acceso óptimo de la luz UV a las células. Este tipo de células se puede utilizar en ensayos que transitoriamente expresar proteínas para la caracterización funcional [ ^{40 , 41]} . Además, la protoplastía se ha aplicado a varios otros tipos de células vegetales y especies ^{42 , 43 , 44} ( por ejemplo, Petersson et al ., 2009; Bargmann y Birnbaum, 2010 y Hong et al ., 2012).

<P class = "jove_content"> El método abarca un total de 11 pasos ( Figura 1A ). Los protoplastos de mesofilo de hoja de Arabidopsis se aislan primero (etapa 1) y posteriormente se irradian con UV para formar mRNPs reticulados (etapa 2). Cuando los protoplastos se lisan en condiciones desnaturalizantes (etapa 3), los mRNP reticulados se liberan en tampón de lisis / unión y se extraen por perlas de oligo-d (T) ₂₅ (etapa 4). Después de varias rondas de lavados rigurosos, los mRNP se purifican y se analizan adicionalmente. Los péptidos desnaturalizados de mRBPs son digeridos por proteinasa K antes de purificar los ARNm reticulados y la calidad de ARN se verifica mediante qRT-PCR (etapas 5 y 6). Después del tratamiento con RNasa y la concentración de proteína (etapa 7), la calidad de la proteína se controla mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) y tinción con plata (etapa 8). La diferencia en los patrones de bandas de proteína puede visualizarse fácilmente entre una muestra reticulada (CL) y una muestra no reticulada (no CL;La muestra de control negativo de protoplastos que no está sometida a irradiación UV). La identificación de proteínas se logra mediante la proteómica basada en la EM. Las proteínas de la muestra de CL se separan mediante electroforesis unidimensional en gel de poliacrilamida (1D-PAGE) para eliminar la posible contaminación de fondo, se digieren en gel en péptidos cortos usando tripsina y se purifican (etapa 9). La cromatografía líquida de fase inversa nanométrica acoplada a espectrometría de masas (nano-LC-MS) permite la determinación de la cantidad de proteínas definitivas en el proteoma ligado al mRNA (paso 10). Finalmente, las mRBPs identificadas se caracterizan y catalogan usando el análisis bioinformático (paso 11).