Хондрогенное образование гранул из индуцированных пуповинной клеткой флуоресцентных стволовых клеток

Использование hiPSC представляет собой новую стратегию скрининга наркотиков и механистических исследований различных заболеваний. С точки зрения регенерации hiPSCs также являются потенциальным источником для замены поврежденных тканей с ограниченной лечебной способностью, таких как суставной хрящ ^{1 , 2} .

Регенерация нативного суставного хряща была проблемой в течение нескольких десятилетий. Суставной хрящ представляет собой мягкую белую ткань, которая покрывает конец костей, защищая их от трения. Однако при повреждении он обладает ограниченной регенеративной способностью, что делает самовосстановление практически невозможным. Поэтому исследования, посвященные регенерации хряща, продолжаются в течение нескольких десятилетий.

Раньше дифференцировку in vitro в хондрогенную линию обычно проводили с BMSCs или нативными хондроцитами, выделенными из коленного сустава ³ . Из-за tO их хондрогенный потенциал, BMSCs и родные хондроциты имеют многочисленные достоинства, поддерживающие их использование в хондрогенезе. Однако из-за их ограниченного расширения и нестабильного фенотипа эти клетки сталкиваются с несколькими ограничениями в восстановлении дефектов суставного хряща. В условиях культивирования in vitro эти клетки, как правило, теряют свои характеристики после 3-4 проходов, что в конечном итоге влияет на их способности к дифференциации ⁴ . Кроме того, в случае местных хондроцитов дополнительный ущерб коленному суставу неизбежен при получении этих клеток.

В отличие от BMSC или родных хондроцитов hiPSCs могут неограниченно расширяться in vitro . При надлежащих условиях культивирования hiPSCs обладают большим потенциалом в качестве источника замены хондрогенной дифференциации. Тем не менее, сложно изменить внутренние характеристики hiPSCs ⁵ . Кроме того, требуется несколько сложных in vitro stePs, чтобы направить судьбу hiPSCs на определенный тип ячейки. Несмотря на эти осложнения, использование hiPSC по-прежнему рекомендуется из-за их высоких способностей к самообновлению и их способности дифференцироваться в целевые клетки, включая хондроциты.

Хондрогенную дифференцировку обычно проводят с помощью трехмерных систем культивирования, таких как культура гранул или культура микромассы, с использованием MSC-подобных клеток-предшественников. При использовании hiPSC протокол для генерации MSC-подобных клеток-предшественников отличается от существующих протоколов. Некоторые группы используют монослойную культуру hiPSCs для прямого преобразования фенотипа в MSC-подобные клетки ⁷ . Тем не менее, в большинстве исследований используется EB для генерации клеток выроста, которые напоминают MSC ^{8 , 9 , 10 , 11} .

Различные типы факторов роста используются для индуцирования хондрогаНесис. Обычно белки семейства BMP и TGFβ используются отдельно или в комбинации. Дифференциация также была вызвана другими факторами, такими как GDF5, FGF2 и IGF1 ^{12 , 13 , 14 , 15} . Показано, что TGFβ1 стимулирует хондрогенез дозозависимым образом в MSC ¹⁶ . По сравнению с другим изотипом TGFβ3, TGFβ1 индуцирует хондрогенез путем увеличения консиляции мезенхимальных клеток перед хрящами. TGFβ3 индуцирует хондрогенез путем значительного увеличения пролиферации мезенхимных клеток ¹⁷ . Однако TGFβ3 чаще используется исследователями, чем TGFβ1 ^{7 , 10 , 18 , 19} . BMP2 усиливает экспрессию генов, связанных с компонентами хондрогенной матрицы у человекаСуставные хондроциты в условиях in vitro ²⁰ . BMP2 увеличивает экспрессию генов, критически важных для образования хряща в MSC, в комбинации с белками TGFβ ²¹ . Было также показано, что BMP2 синергически усиливает действие TGFβ3 через пути Smad и MAPK ²² .

В этом исследовании CBMC-hiPSCs были объединены в EBs с использованием EB-среды в чашке Petri с низким прилеганием. Клетки отростков индуцировали присоединением EBs к тарелке, покрытой желатином. Хондрогенную дифференцировку с использованием клеток выроста проводили культурой гранул. Обработка как BMP2, так и TGFβ3 успешно конденсировала клетки и индуцировала накопление белка внеклеточного матрикса (ECM) для образования хондрогенных гранул. В этом исследовании предлагается простой, но эффективный протокол хондрогенной дифференцировки с использованием CBMC-hiPSC.