تشكيل بيليه غضروفي من الخلايا الجذعية المحفزة المستمدة من الدم الحبلية
Summary
هنا، نقترح بروتوكولا للتمايز غضروفي من خلايا الدم الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة.
Abstract
الغضروف المفصلي الإنسان يفتقر إلى القدرة على إصلاح نفسها. وبالتالي يتم علاج انحطاط الغضروف ليس عن طريق العلاجية ولكن عن طريق العلاجات المحافظة. حاليا، تبذل جهود لتجديد الغضروف التالفة مع السابقين فيفو توسيع غضروفية أو الخلايا الجذعية الوسيطة المستمدة من نخاع العظم (بمسك). ومع ذلك، فإن قابلية محدودة وعدم استقرار هذه الخلايا تحد تطبيقها في إعادة بناء الغضروف. وقد تلقت الخلايا الجذعية المحفزة البشرية (هيبسس) اهتماما علميا كبديل جديد للتطبيقات التجدد. مع القدرة على التجديد الذاتي غير محدود والتعدد، وقد تم تسليط الضوء على هيبسس كمصدر بديل خلية جديدة لإصلاح الغضاريف. ومع ذلك، والحصول على كمية عالية من الكريات تشوندروجيك عالية الجودة هو التحدي الرئيسي لتطبيق السريري. في هذه الدراسة، استخدمنا الخلايا الجنينية (إب) – خلايا النمو المكتشفة للتمايز غضروفي. وأكدت تشوندروجينيسيس الناجحة عن طريق ير أد تلطيخ مع الأزرق ألسيان، الأزرق تولويدين، والأجسام المضادة ضد أنواع الكولاجين الأول والثاني (COL1A1 و COL2A1، على التوالي). نحن نقدم طريقة مفصلة لتفريق الدم الحبل النوى أحادي النواة إيبسس المستمدة من الخلايا (كبمك-هيبسس) في الكريات تشوندروجينيك.
Introduction
استخدام هيبسس يمثل استراتيجية جديدة لفحص المخدرات والدراسات الميكانيكية من مختلف الأمراض. من منظور التجدد، هيبسس هي أيضا مصدر محتمل لاستبدال الأنسجة التالفة التي لديها القدرة على الشفاء محدودة، مثل الغضروف المفصلي 1 ، 2 .
كان تجديد الغضروف المفصلي الأصلي تحديا لعدة عقود. غضروف المفصلي هو لينة، والأنسجة البيضاء التي تغلف نهاية العظام، وحمايتها من الاحتكاك. ومع ذلك، فقد قدرة التجدد محدودة عندما تضررت، الأمر الذي يجعل إصلاح الذاتي يكاد يكون من المستحيل. ولذلك، فإن الأبحاث التي تركز على تجديد الغضروف مستمرة منذ عدة عقود.
سابقا، في التمايز المختبر في النسب غضروفية عادة ما يتم تنفيذ مع بمسكس أو غضروفية الأصلي معزولة من مفصل الركبة 3 . بسبب tس إمكانات تشوندروجينيك، بمسكس والغضروفية الأصلية لديها العديد من المزايا دعم استخدامها في تشوندروجينيسيس. ومع ذلك، بسبب التوسع المحدود والنمط الظاهري غير المستقر، تواجه هذه الخلايا عدة قيود في إعادة بناء عيوب الغضروف المفصلي. تحت ظروف الثقافة في المختبر ، وهذه الخلايا تميل إلى فقدان خصائصها بعد 3-4 الممرات، والتي تؤثر في نهاية المطاف قدراتهم التمايز 4 . أيضا، في حالة غضروفية محلية، أضرار إضافية إلى مفصل الركبة أمر لا مفر منه عند الحصول على هذه الخلايا.
على عكس بمسكس أو غضروفية الأم، يمكن هبسس توسيع إلى أجل غير مسمى في المختبر . مع ظروف الثقافة المناسبة، هبسس لديها إمكانات كبيرة كمصدر بديل للتمايز غضروفي. ومع ذلك، فإنه من الصعب تغيير الخصائص الجوهرية لل هيبس 5 . وعلاوة على ذلك، فإنه يأخذ عدة تعقيدا في المختبر ستيبس لتوجيه مصير هيبس إلى نوع خلية محددة. على الرغم من هذه المضاعفات، لا يزال ينصح باستخدام هيبسس بسبب قدراتهم الذاتية التجديد الذاتي وقدرتها على التفريق في الخلايا المستهدفة، بما في ذلك غضروفية 6 .
وعادة ما يتم التمايز غضروفية مع نظم الثقافة ثلاثية الأبعاد، مثل ثقافة بيليه أو الثقافة ميكروماس، وذلك باستخدام الخلايا السلف مثل مسك. إذا كان استخدام هيبس، بروتوكول لتوليد الخلايا السلف مثل مسك يختلف عن البروتوكولات الموجودة. بعض المجموعات تستخدم ثقافة أحادي الطبقة من هبسس لتحويل مباشرة النمط الظاهري إلى الخلايا مثل مسك 7 . ومع ذلك، فإن معظم الدراسات تستخدم إبس لتوليد خلايا النمو التي تشبه مسس 8 ، 9 ، 10 ، 11 .
وتستخدم أنواع مختلفة من عوامل النمو للحث على تشوندروجnesis. عادة، يتم استخدام البروتينات الأسرة بمب و TGF،، وحدها أو في تركيبة. وقد تم تحفيز التمايز أيضا مع عوامل أخرى، مثل GDF5، FGF2، و IGF1 12 ، 13 ، 14 ، 15 . وقد تبين TGFβ1 لتحفيز غضروفية في طريقة تعتمد على الجرعة في اللجان الدائمة 16 . بالمقارنة مع النمط النظري الآخر، TGFβ3، TGFβ1 يدفع تشوندروجينيسيس عن طريق زيادة الغضروف الخلية الوسيطة التكثيف.TGFβ3 يدفع تشوندروجينيسيس عن طريق زيادة كبيرة في انتشار الخلايا الوسيطة 17 . ومع ذلك، TGFβ3 يستخدم بشكل متكرر أكثر من الباحثين من TGFβ1 7 ، 10 ، 18 ، 19 . BMP2 يعزز التعبير عن الجينات المتعلقة مكونات مصفوفة غضروفية في الإنسانغضروفي مفصلي تحت ظروف المختبر 20 . BMP2 يزيد من التعبير عن الجينات الحيوية لتشكيل الغضروف في اللجان الدائمة في تركيبة مع البروتينات TGF 21 21 . وقد تبين أيضا أن PMP2 يعزز بشكل تعاوني تأثير TGFβ3 من خلال مسارات سماد و مابك 22 .
في هذه الدراسة، تم تجميع كبمك-هيبسس في إبس باستخدام المتوسطة إب في طبق بتري منخفضة المرفقات. وكانت الخلايا الناتجة عن إرفاق إبس إلى طبق المغلفة الجيلاتين. تم إجراء تمايز غضروفي باستخدام خلايا النمو بواسطة ثقافة بيليه. العلاج مع كل من BMP2 و TGFβ3 تكثف بنجاح الخلايا وتسببها المصفوفة خارج الخلية (إسم) تراكم البروتين لتشكيل بيليه تشوندروجينيك. وتقترح هذه الدراسة بروتوكول التمايز تشوندروجيك بسيطة ولكنها فعالة باستخدام كبمك-هيبسس.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول ولدت بنجاح هيبسس من كبمس. نحن إعادة برمجة كبمكس ل هبسس باستخدام ناقلات الفيروسية سينداي التي تحتوي على عوامل ياماناكا 24 . تم استخدام ثلاث حالات في التمايز، وجميع التجارب ولدت بنجاح الكريات تشوندروجيك باستخدام هذا البروتوكول. وقد ذكرت الع?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل منحة من مشروع البحث والتطوير في مجال الرعاية الصحية الكورية، وزارة الصحة والرعاية الاجتماعية وشؤون الأسرة، جمهورية كوريا (HI16C2177).
Materials
| Plasticware | |||
| 100mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| Name | Company | Catalog Number | Description |
| E8 Medium Materials | |||
| DMEM/F12, HEPES | Life Technologies | 11330-057 | E8 Medium (500 mL) |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080-094 | E8 Medium (Conc.: 543 μg/mL) |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | E8 Medium (Conc.: 14 ng/mL) |
| Human Transfferin | Sigma Aldrich | T3705 | E8 Medium (Conc.: 10.7 μg/mL) |
| Basic FGF2 | Peprotech | 100-18B | E8 Medium (Conc.: 100 ng/mL) |
| Human Insulin | Life Technologies | 12585-014 | E8 Medium (Conc.: 20 μg/mL) |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | E8 Medium (Conc.: 2 ng/mL) |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | E8 Medium (Conc.: 64 μg/mL) |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Name | Company | Catalog Number | Description |
| Quality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Tween 20 | BIOSESANG | T1027 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-Collagen II antibody | abcam | ab34712 | 1:100 |
| Alcian blue | Sigma Aldrich | A3157-10G | |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich | F7252-25G | |
| Safranin O | Sigma Aldrich | 090m0039v | |
| Nuclear fast red | Americanmastertech | STNFR100 | |
| xylene | Duksan | 115 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| Mayer's hematoxylin solution | wako pure chemical industries | LAK7534 | |
| DAP | VECTOR LABORATORIES | SK-4100 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| Name | Company | Catalog Number | Description |
| Chondrogenic Differentiation Materials | |||
| DMEM | Life Technologies | 11885 | Chondrogenic media component (500 mL) |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | Chondrogenic media component (Conc.: 1 %) |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | Chondrogenic media component (Conc.: 64 μg/mL) |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140-050 | Chondrogenic media component (Conc.: 100 mM) |
| rhBMP-2 | R&D | 355-BM-050 | Chondrogenic media component (Conc.:100ng/ml) |
| Recombinant Hman TGF-beta3 | R&D | 243-B3-002 | Chondrogenic media component (Conc.:10ng/ml) |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Chondrogenic media component (Conc.: 1 %) |
| ITS+ Premix | BD | 354352 | Chondrogenic media component (Conc.: 1 %) |
| Dexamethasone-Water Soluble | Sigma Aldrich | D2915-100MG | Chondrogenic media component (Conc.:10-7 M) |
| GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050-061 | Chondrogenic media component (Conc.: 1 %) |
| Sodium pyruvate solution | Sigma Aldrich | S8636 | Chondrogenic media component (Conc.: 1 %) |
| L-Proline | Sigma Aldrich | P5607-25G | Chondrogenic media component (40μg/ml) |
References
- van Osch, G. J., et al. Cartilage repair: past and future–lessons for regenerative medicine. J Cell Mol Med. 13 (5), 792-810 (2009).
- Ahmed, T. A., Hincke, M. T. Strategies for articular cartilage lesion repair and functional restoration. Tissue Eng Part B Rev. 16 (3), 305-329 (2010).
- Diekman, B. O., et al. Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).
- Solchaga, L. A., Penick, K., Goldberg, V. M., Caplan, A. I., Welter, J. F. Fibroblast growth factor-2 enhances proliferation and delays loss of chondrogenic potential in human adult bone-marrow-derived mesenchymal stem cells. Tissue Eng Part A. 16 (3), 1009-1019 (2010).
- Guzzo, R. M., Drissi, H. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells to Chondrocytes. Methods Mol Biol. 1340, 79-95 (2015).
- Drissi, H., Gibson, J. D., Guzzo, R. M., Xu, R. H. Derivation and Chondrogenic Commitment of Human Embryonic Stem Cell-Derived Mesenchymal Progenitors. Methods Mol Biol. 1340, 65-78 (2015).
- Nejadnik, H., et al. Improved approach for chondrogenic differentiation of human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 11 (2), 242-253 (2015).
- Teramura, T., et al. Induction of mesenchymal progenitor cells with chondrogenic property from mouse-induced pluripotent stem cells. Cell Reprogram. 12 (3), 249-261 (2010).
- Koyama, N., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiated into chondrogenic lineage via generation of mesenchymal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 102-113 (2013).
- Ko, J. Y., Kim, K. I., Park, S., Im, G. I. In vitro chondrogenesis and in vivo repair of osteochondral defect with human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (11), 3571-3581 (2014).
- Nam, Y., Rim, Y. A., Jung, S. M., Ju, J. H. Cord blood cell-derived iPSCs as a new candidate for chondrogenic differentiation and cartilage regeneration. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 16 (2017).
- Hotten, G. C., et al. Recombinant human growth/differentiation factor 5 stimulates mesenchyme aggregation and chondrogenesis responsible for the skeletal development of limbs. Growth Factors. 13 (1-2), 65-74 (1996).
- Murphy, M. K., Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. TGF-beta1, GDF-5, and BMP-2 stimulation induces chondrogenesis in expanded human articular chondrocytes and marrow-derived stromal cells. Stem Cells. 33 (3), 762-773 (2015).
- Shintani, N., Siebenrock, K. A., Hunziker, E. B. TGF-ss1 enhances the BMP-2-induced chondrogenesis of bovine synovial explants and arrests downstream differentiation at an early stage of hypertrophy. PLoS One. 8 (1), e53086 (2013).
- Fukumoto, T., et al. Combined effects of insulin-like growth factor-1 and transforming growth factor-beta1 on periosteal mesenchymal cells during chondrogenesis in vitro. Osteoarthritis Cartilage. 11 (1), 55-64 (2003).
- Worster, A. A., Nixon, A. J., Brower-Toland, B. D., Williams, J. Effect of transforming growth factor beta1 on chondrogenic differentiation of cultured equine mesenchymal stem cells. Am J Vet Res. 61 (9), 1003-1010 (2000).
- Knippenberg, M., et al. Differential effects of bone morphogenetic protein-2 and transforming growth factor-beta1 on gene expression of collagen-modifying enzymes in human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Tissue Eng Part A. 15 (8), 2213-2225 (2009).
- Jang, Y., et al. Centrifugal gravity-induced BMP4 induces chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells via SOX9 upregulation. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 184 (2016).
- Kang, R., et al. Mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells retain adequate osteogenicity and chondrogenicity but less adipogenicity. Stem Cell Res Ther. 6, 144 (2015).
- Tao, H., et al. Biological evaluation of human degenerated nucleus pulposus cells in functionalized self-assembling peptide nanofiber hydrogel scaffold. Tissue Eng Part A. 20 (11-12), 1621-1631 (2014).
- Sekiya, I., Larson, B. L., Vuoristo, J. T., Reger, R. L., Prockop, D. J. Comparison of effect of BMP-2, -4, and -6 on in vitro cartilage formation of human adult stem cells from bone marrow stroma. Cell Tissue Res. 320 (2), 269-276 (2005).
- Shen, B., Wei, A., Tao, H., Diwan, A. D., Ma, D. D. BMP-2 enhances TGF-beta3-mediated chondrogenic differentiation of human bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells in alginate bead culture. Tissue Eng Part A. 15 (6), 1311-1320 (2009).
- Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation. J Vis Exp. (118), (2016).
- Kim, Y., et al. The Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Blood Cells: An Efficient Protocol Using Serial Plating of Reprogrammed Cells by Centrifugation. Stem Cells Int. 2016, 1329459 (2016).
- Oldershaw, R. A., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes. Nat Biotechnol. 28 (11), 1187-1194 (2010).
- Toh, W. S., et al. Differentiation and enrichment of expandable chondrogenic cells from human embryonic stem cells in vitro. J Cell Mol Med. 13 (9B), 3570-3590 (2009).
- Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. Derivation of chondrogenically-committed cells from human embryonic cells for cartilage tissue regeneration. PLoS One. 3 (6), e2498 (2008).
- Nakagawa, T., Lee, S. Y., Reddi, A. H. Induction of chondrogenesis from human embryonic stem cells without embryoid body formation by bone morphogenetic protein 7 and transforming growth factor beta1. Arthritis Rheum. 60 (12), 3686-3692 (2009).
- Guzzo, R. M., Scanlon, V., Sanjay, A., Xu, R. H., Drissi, H. Establishment of human cell type-specific iPS cells with enhanced chondrogenic potential. Stem Cell Rev. 10 (6), 820-829 (2014).
- Rim, Y. A., Park, N., Nam, Y., Ju, J. H. Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients. J Vis Exp. (116), (2016).
- Pfaff, N., et al. Efficient hematopoietic redifferentiation of induced pluripotent stem cells derived from primitive murine bone marrow cells. Stem Cells Dev. 21 (5), 689-701 (2012).
- Xu, H., et al. Highly efficient derivation of ventricular cardiomyocytes from induced pluripotent stem cells with a distinct epigenetic signature. Cell Res. 22 (1), 142-154 (2012).
- Lee, S. B., et al. Contribution of hepatic lineage stage-specific donor memory to the differential potential of induced mouse pluripotent stem cells. Stem Cells. 30 (5), 997-1007 (2012).
- Hu, S., et al. Effects of cellular origin on differentiation of human induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells. JCI Insight. 1 (8), 1-12 (2016).
- Vonk, L. A., de Windt, T. S., Slaper-Cortenbach, I. C., Saris, D. B. Autologous, allogeneic, induced pluripotent stem cell or a combination stem cell therapy? Where are we headed in cartilage repair and why: a concise review. Stem Cell Res Ther. 6 (94), 1-11 (2015).
- Gomez-Leduc, T., et al. Chondrogenic commitment of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in collagen matrices for cartilage engineering. Sci Rep. 6, 32786 (2016).
- Mareschi, K., et al. Isolation of human mesenchymal stem cells: bone marrow versus umbilical cord blood. Haematologica. 86 (10), 1099-1100 (2001).
- Wexler, S. A., et al. Adult bone marrow is a rich source of human mesenchymal ‘stem’ cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not. Br J Haematol. 121 (2), 368-374 (2003).
- Zhang, X., et al. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from human umbilical cord blood: reevaluation of critical factors for successful isolation and high ability to proliferate and differentiate to chondrocytes as compared to mesenchymal stem cells from bone marrow and adipose tissue. J Cell Biochem. 112 (4), 1206-1218 (2011).
- Wagner, W., et al. Replicative senescence of mesenchymal stem cells: a continuous and organized process. PLoS One. 3 (5), e2213 (2008).
- Tarte, K., et al. Clinical-grade production of human mesenchymal stromal cells: occurrence of aneuploidy without transformation. Blood. 115 (8), 1549-1553 (2010).
- Chen, W. C., et al. Prediction of poor survival by cyclooxygenase-2 in patients with T4 nasopharyngeal cancer treated by radiation therapy: clinical and in vitro studies. Head Neck. 27 (6), 503-512 (2005).
- Guzzo, R. M., Gibson, J., Xu, R. H., Lee, F. Y., Drissi, H. Efficient differentiation of human iPSC-derived mesenchymal stem cells to chondroprogenitor cells. J Cell Biochem. 114 (2), 480-490 (2013).
