UNE<em> Caenorhabditis elegans</em> Ensemble d'aversion en cuivre à base d'état nutritionnel
Summary
Ici, nous présentons un dosage spécifique de Caenorhabditis elegans conçu pour évaluer les changements dans le comportement d'aversion au cuivre et la capacité de localiser une source alimentaire commune, à mesure que l'organisme progresse d'un état nutritionnel nourri à un affamé.
Abstract
Pour assurer la survie, les organismes doivent être capables d'éviter des habitats défavorables tout en assurant une source alimentaire constante. Caenorhabditis elegans modifie ses caractéristiques locomotrices lors de la détection de divers stimuli environnementaux et peut moduler leur suite de réponses comportementales en réponse à des conditions de famine. Les nématodes présentent généralement une diminution de la réponse aversive lorsqu'ils sont éliminés d'une source alimentaire pendant plus de 30 minutes. L'observation des changements comportementaux en réponse à un état nutritionnel changeant peut donner un aperçu des mécanismes qui régulent la transition d'un état bien nourri à un état affamé.
Nous avons développé un dosage qui mesure la capacité d'un nématode à traverser une barrière aversive ( c.-à-d. Le cuivre) puis atteindre une source alimentaire pendant une période prolongée. Ce protocole s'appuie sur les travaux antérieurs en intégrant plusieurs variables d'une manière qui permet une collecte continue de données lorsque les organismes se déplacent vers unN condition de plus en plus affamé. En outre, ce dosage permet une augmentation de la taille de l'échantillon afin que les populations de nématodes plus grandes puissent être évaluées simultanément.
Les organismes défectueux pour détecter ou répondre au cuivre traversent immédiatement la barrière chimique, alors que les nématodes de type sauvage sont initialement repoussés. Comme les vers de type sauvage sont de plus en plus affamés, ils commencent à traverser la barrière et à atteindre la source de nourriture. Nous avons conçu ce dosage pour évaluer un mutant incapable de répondre à des indices environnementaux divers, y compris la sensation alimentaire ou la détection de produits chimiques aversifs. Lorsqu'ils ont été évalués via ce protocole, les organismes défectueux ont immédiatement traversé la barrière, mais ont également été incapables de détecter une source de nourriture. Par conséquent, ces mutants traversent à plusieurs reprises la barrière chimique malgré une entrée temporaire d'une source alimentaire. Ce test permet de tester directement les populations de vers afin d'évaluer les défauts potentiels liés à l'aversion et à la famine.
Introduction
Caenorhabditis elegans a été utilisé comme modèle pour l'étude de la neurobiologie pendant des décennies en raison de la facilité relative dans l'analyse des circuits d'un système nerveux composé de seulement 302 neurones 1 . Pourvu que l'organisme dépend de la réponse aux signaux environnementaux, une grande partie du système nerveux est dédié à la régulation de l'intégration des signaux environnementaux 2 . Malgré la simplicité de son système nerveux, C. elegans peut détecter et répondre à divers signaux environnementaux, y compris les répulsifs 3 , les attractifs 4 , la température 5 et même l'humidité 6 . Un échec à intégrer correctement les signaux environnementaux a été lié à un certain nombre de troubles du comportement et des états neurodégénératifs dans les systèmes modèles de mammifères 7 à 9 . Avec une gamme de modèles disponibles de maladies neurales 10 dans C. elegans et le développement des écrans pharmaceutiques de nématodes 11 , cet organisme s'est avéré être un système utile pour l'étude de la neurobiologie. Compte tenu de la disponibilité d'un connecteur 1 de nématode cartographique et de mutations de presque tous les gènes du génome 12 du nématode, notre compréhension du système nerveux des nématodes et, par extension, est partiellement limitée par la conception d'essais créatifs appropriés.
Un certain nombre de tests de chimiotaxis ont été développés au cours des 40 dernières années pour évaluer la réactivité des nématodes à divers stimuli aversifs 3 , 4 , 13 , 14 , 15 . L'expérimentation initiale impliquait l'introduction d'une stimulation environnementale aiguë tandis qu'un seul ver gremed sur une plaque d'agar= "Xref"> 3 , 14 , 16 . Les modifications immédiates apportées aux réponses locomotrices ont été enregistrées. Par exemple, l'octanol odorant volatil peut être appliqué sur un cheveu et flanqué devant le nez d'un nématode pour stimuler l'initiation de la locomotion vers l'arrière dans les vers sauvages 17 . Des tests plus complexes ont également été développés pour incorporer de multiples variables comme moyen d'évaluer le choix du comportement 18 . Une variation de ce dosage implique l'utilisation d'une solution de cuivre pour créer une barrière de ligne médiane aversive 4 . Un attirant, à savoir le diacétyle, a été placé d'un côté de la barrière chimique avec des vers transférés à l'écart de la source de diacétyle. Les vers défectueux pour les réponses aversives au cuivre ont immédiatement traversé la barrière pour atteindre le diacétyle, tandis que les vers de type sauvage ont d'abord été repoussés par la barrière. Les réponses ont été marquées lorsque les vers se sont approchés de la barrière de cuivreSans observations à long terme.
Lorsque les vers sont évalués après avoir subi des conditions de famine, leur sensibilité aux stimuli environnementaux diminue 19 . Lorsque l'octanol chimique aversif est flotté devant le nez des nématodes, les organismes de type sauvage stimulent le mouvement vers l'arrière en 3 à 5 s lorsqu'ils sont alimentés. Après que ces organismes ont été retirés des aliments pendant 10 min, ils présentent une réponse retardée de 8 à 10 s 20 . Ainsi, avec une famine accrue, les nématodes affichent une diminution de la réponse aversive aux signaux environnementaux nuisibles car la recherche d'aliments devient plus essentielle à la survie. À l'inverse, les nématodes qui exagèrent le récepteur neuropéptidique 9 ( npr-9) ne répondent pas à l'octanol sur ou hors de l'alimentation et présentent une incapacité à répondre à un certain nombre de stimulants aversifs 21 . Ces organismes npr-9 (GF) ne modulent pas non plus leur fréquence d'inversion en présence d'aliments, mais peuventInversée en réponse à des stimulations tactiles sévères indiquant qu'elles sont capables de se déplacer vers l'arrière 21 . Nous avons également évalué les mutants npr-9 (LF) étant donné qu'ils présentent une fréquence d'inversion anormalement diminuée des aliments, mais peuvent moduler leur comportement en présence de nourriture 21 . Le couplage de l'état nutritionnel du ver avec l'introduction de stimuli externes aiguë a aidé à élucider les mécanismes par lesquels une voie alimentaire peut moduler largement les voies de signalisation sensorielle 22 , 23 . La présence d'aliments dans l'environnement des nématodes a également été utilisée pour évaluer les réponses au retrait de l'éthanol 24 . Dans cette expérience, les vers ont été incubés à différentes concentrations d'éthanol, puis ont été placés sur une plaque d'agar avec un morceau de nourriture connu sous le nom de "test de race alimentaire". Le patch alimentaire a été placé sur un bord de la plaque alors que les nématodes wÉtaient séparés de la source de nourriture. Le retrait de l'éthanol a été évalué en mesurant la durée de temps nécessaire pour que les vers atteignent le morceau de nourriture.
Ce test d'aversion en cuivre à base de nutriments s'appuie sur l'analyse alimentaire pour intégrer d'autres variables environnementales, à savoir l'alimentation et le cuivre, tout en évaluant les changements de comportement dans le temps. Il s'agit d'une adaptation d'un protocole communément utilisé dans la communauté de C. elegans 4 . Ce protocole a été utilisé pour évaluer les réponses aversives et la détection des aliments sur une période de quatre heures 21 . Étant donné que les comportements de famine de l'exposition de ver après 30 minutes de privation de nourriture 25 , nous sommes également en mesure d'évaluer comment les changements d'état nutritionnel peuvent influencer les réponses environnementales. Les conditions de ce dosage mesurent la façon dont les organismes expérimentaux changent de réactivité aux stimuli aversifs au fil du temps, ce qui évalue les changements de comportement commeLes organismes progressent vers un état affamé (et des mesures continues de la famine prolongée). Étant donné que les animaux npr-9 (GF) ne modifient pas leur comportement en réponse à de la nourriture ou de nombreux indices aversifs, nous avons cherché à identifier si ces déficits comportementaux persisteraient dans le contexte de la famine. En fin de compte, cette conception de dosage a été formulée pour évaluer spécifiquement les mutants npr-9 (GF) mais peut être davantage adaptée pour caractériser également de nouvelles souches.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette conception de dosage modifie l'essai de course alimentaire 24 pour inclure une solution de cuivre pour créer une barrière de ligne médiane aversive et autour du bord de la plaque pour empêcher une perte de nématodes. Les organismes sont testés pour leur capacité à traverser la barrière aversive et à atteindre un patch alimentaire sur une période de 4 h. Dans le contexte de npr-9 (GF) , nous avons utilisé ce dosage pour évaluer comment les conditions de famine pourr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada Discovery Grant RGPIN36481-08 à William G. Bendena.
Materials
| M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.] | Produced in lab | ||
| Cupric Sulfate | Sigma | C-1297 | Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M |
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