에이<em> Caenorhabditis elegans</em> 영양 상태 기반 구리 혐오 검정
Summary
여기에서 우리는 구리 혐오 행동의 변화와 일반적인 음식 공급원을 찾아내는 능력을 평가하기 위해 고안된 Caenorhabditis elegans 특이 적 검정법을 제시합니다. 유기체가 잘 먹는 것에서 굶주린 영양 상태로 진행되기 때문입니다.
Abstract
생존을 보장하기 위해 유기체는 일관성없는 식량 원천을 확보하면서 부적절한 서식지를 피할 수 있어야합니다. Caenorhabditis elegans 는 다양한 환경 적 자극을 감지하면 운동 패턴을 변경하고 기아 상태에 반응하여 행동 반응을 조절할 수 있습니다. 선충류는 일반적으로 30 분 이상 식량 공급원에서 제거되면 감소 된 혐오 반응을 보입니다. 변화하는 영양 상태에 대한 행동 변화의 관찰은 잘 먹는 상태에서 굶주린 상태로의 전환을 규제하는 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
우리는 혐오 장벽 ( 예 : 구리)을 통과하여 장기간에 걸쳐 음식물에 도달하는 선충류의 능력을 측정하는 분석법을 개발했습니다. 이 프로토콜은 이전의 작업을 바탕으로, 유기체가 a로 이동함에 따라 계속적인 데이터 수집을 허용하는 방식으로 여러 변수를 통합합니다.점점 더 굶주린 상태. 더욱이,이 분석은 선충의 더 큰 집단이 동시에 평가 될 수 있도록 증가 된 표본 크기를 허용한다.
구리를 감지하거나 반응하는 능력에 결함이있는 생물체는 즉시 화학 장벽을 가로 지르는 반면, 야생형 선충은 초기에 쫓겨납니다. 야생형 벌레는 점점 더 굶어 죽어 가면서 장벽을 넘어 식량 공급원에 도달하기 시작합니다. 우리는 식품 감각이나 혐오 화학 물질 검출 등 다양한 환경 신호에 반응 할 수없는 돌연변이 체를 평가하기 위해이 분석법을 고안했습니다. 이 프로토콜을 통해 평가할 때, 결함있는 유기체는 즉시 장벽을 넘었지만 식량 원천을 탐지 할 수 없었습니다. 따라서 이러한 돌연변이 체는 일시적으로 식품 공급원에 도달 함에도 불구하고 화학 장벽을 반복적으로 교차합니다. 이 분석은 혐오감과 기아와 관련된 잠재적 인 경로 결함을 평가하기 위해 웜 집단을 직접 테스트 할 수 있습니다.
Introduction
Caenorhabditis elegans 는 단지 302 개의 뉴런으로 구성된 신경계의 회로 분석이 상대적으로 용이하기 때문에 수십 년 동안 신경 생물학 연구의 모델로 사용되었습니다 1 . 유기체가 환경 신호에 반응하는 것에 의존한다면, 신경계의 대부분은 환경 신호의 통합을 규제하는 데 전념합니다 2 . 신경계의 단순함에도 불구하고 C. elegans 는 방수제 3 , 유인물 4 , 온도 5 , 습도 6 등 다양한 환경 신호를 감지하고 이에 대응할 수 있습니다. 제대로 환경 신호를 통합하는 실패는 포유 동물 모델 시스템 7-9에서 행동 장애 및 신경 퇴행성 조건의 번호로 연결되어 있습니다. 이용 가능한 다양한 신경 질환 모델 C. elegans의 10 개 및 선충류 약제 스크린 11 의 개발과 관련하여이 미생물은 신경 생물학 연구에 유용한 시스템으로 입증되었습니다. 선충류 게놈 12 의 거의 모든 유전자에 매핑 된 선충 인 connectome 1 과 돌연변이의 이용 가능성을 감안할 때, 선충류 신경계에 대한 우리의 이해와 우리 자신의 확장은 창조적으로 적절한 분석법의 디자인에 의해 부분적으로 제한됩니다.
다양한 혐오 자극 3 , 4 , 13 , 14 , 15에 대한 선충 반응성을 평가하기 위해 지난 40 년간 여러 chemotaxis 분석법이 개발되었습니다. 초기 실험은 단일 한 벌레가 한천 판에 배회하는 동안 급성 환경 자극의 도입과 관련되었다= "xref"> 3 , 14 , 16 . 기관지 반응에 대한 즉각적인 변화가 기록되었다. 예를 들어, 휘발성 냄새 물질 인 옥탄 올은 모발에 적용되어 선충의 코 앞에서 떠돌며 야생형 벌레 17 에서 역방향 이동의 시작을 자극 할 수 있습니다. 더 복잡한 분석은 행동의 선택 (18)을 평가하는 수단으로 여러 변수를 포함하도록 개발되어왔다. 이 분석의 변형은 혐오 정중선 배리어 (4)를 제작하는 구리 용액의 사용을 수반한다. 유인물, 즉 디아 세틸은 디아 세틸 공급원으로부터 멀리 이동 된 벌레가있는 화학 장벽의 한쪽면에 놓였습니다. 구리 혐오 반응에 결함이있는 웜은 diacetyl에 도달하는 장벽을 즉시 넘어 섰고 야생 타입 웜은 장벽에 의해 처음에 격퇴되었습니다. 웜이 처음으로 구리 장벽에 접근했을 때 응답이 득점되었습니다.장기간의 관찰없이
굶주림 상태를 겪은 후에 웜을 평가하면 환경 자극에 대한 민감도가 감소합니다 19 . 혐오 화학 옥탄 올이 선충류 앞에서 떠돌 았을 때, 야생형 유기체는 음식에있을 때 3-5 초 내에 거꾸로 움직임을 자극합니다. 10 초 20 -이 생물은 10 분 동안 음식에서 제거 된 후, 그들은 8의 지연 응답을 나타낸다. 따라서 굶주림이 증가하면 선충류는 생존을 위해 음식을 찾는 것이 필수적이 될 때 해로운 환경 신호에 대한 회피 반응이 감소하는 결과를 낳습니다. 반대로, 과도하게 표현 신경 펩티드 수용체 9 (NPR-9), 또는 음식 떨어져 옥탄 올과 혐오 자극 (21)의 수에 대응하는 무능력을 전시에 반응하지 않는 것이 선충. 이 npr-9 (GF) 미생물은 식품 존재시 반전 빈도를 조절하지 않지만들이 거꾸로 운동 (21)의 능력이 강한 것을 나타내는 터치 자극에 응답하여 역방향. 우리는 또한 NPR-9 (LF) 돌연변이들이 음식 (21)의 존재에 자신의 행동을 조절할 수 아직 음식 떨어져 비정상적으로 감소 반전 주파수를 전시 주어진 평가했다. 웜의 영양 상태를 급성 외부 자극의 도입과 결합 시키면 음식 관련 경로가 감각 신호 전달 경로를 광범위하게 조절할 수있는 기전이 밝혀집니다 22 , 23 . 선충류 환경에서 식품의 존재는 에탄올 회수 반응을 평가하는 데에도 사용되었습니다 24 . 이 실험에서 웜을 다양한 농도의 에탄올에서 배양 한 다음 한천 플레이트에 놓고 "food-race assay"라고 불리는 음식 패치를 붙였습니다. 식품 패치는 플레이트의 한쪽 가장자리에 놓고 선충은 w음식 소스에서 멀리 떨어진 장소. 에탄올 철수는 웜이 음식물에 도달하는 데 필요한 시간을 측정하여 평가되었습니다.
이 영양 기반 구리 혐오 분석은 시간 경과에 따른 행동 변화를 평가하는 동안 음식과 구리와 같은 추가 환경 변수를 통합하기 위해 식품 경 쟁 분석을 기반으로합니다. 이것은이 일반적으로 C. elegans의 사회 사를 통해 프로토콜을 사용하는 적응이다. 이 프로토콜은 혐오 반응 및 4 시간 동안의 음식 검출을 평가하는 데 사용되었습니다 21 . 음식 박탈 (25)의 30 분 후 웜의 전시 기아 행동 때문에, 우리는 또한 영양 상태에 변화가 환경의 응답에 영향을 미칠 수있는 방법을 평가할 수 있습니다. 이 분석의 조건은 실험 생물체가 시간이 지남에 따라 혐오적인 자극에 대한 반응을 변화시키는 방법을 측정하므로 행동 변화를 다음과 같이 평가합니다.유기체는 굶어 죽은 상태로 나아 간다 (그리고 연장 된 기아의 계속적인 측정). npr-9 (GF) 동물은 음식이나 많은 혐오 단서에 반응하여 행동을 바꾸지 않기 때문에 이러한 행동 적 결손이 기아와 관련하여 지속되는지 확인하려고했습니다. 궁극적으로,이 분석 디자인은 npr-9 (GF) 돌연변이 체를 특이 적으로 평가하기 위해 제형 화되었지만 새로운 균주의 특성을 규명하기 위해 추가로 적용될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 분석 설계는 선충류의 손실을 방지하는 혐오 중심선과 배리어 판의 가장자리 주위를 제작하는 구리 용액을 포함하는 식품 레이스 분석 24 수정한다. 생물체는 혐오 장벽을 넘어 4 시간 동안 음식물에 도달하는 능력을 테스트합니다. npr-9 (GF) 의 맥락에서, 우리는 기아 조건이 어떻게 혐오 반응과 음식 검출에 영향을 미칠 수 있는지 평가하기 위해이 분석을 활용했습니다…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 협의회 RGPIN36481-08 William G. Bendena의 지원을 받았다.
Materials
| M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.] | Produced in lab | ||
| Cupric Sulfate | Sigma | C-1297 | Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M |
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