Registrazione di plasticità sinaptica in fettine ippocampali Acute mantenuti in un piccolo volume riciclaggio - aspersione- e sistema di immersione-tipo camera
Summary
Questo protocollo descrive la stabilizzazione del livello di ossigeno in un piccolo volume di tampone riciclato e aspetti metodologici della plasticità sinaptica attività-dipendente di registrazione in fettine ippocampali acute sommersi.
Abstract
Anche se gli esperimenti su fettine di cervello sono stati in uso fin dal 1951, permangono problemi che riducono la probabilità di realizzare un’analisi stabile e di successo della modulazione della trasmissione sinaptica durante l’esecuzione di registrazioni sul campo potenziale o intracellulare. Questo manoscritto descrive aspetti metodologici che potrebbero essere utili nel migliorare le condizioni sperimentali per la manutenzione delle fette del cervello acuto e per la registrazione di potenziali postsinaptici eccitatori di campo in una camera di immersione disponibili in commercio con un’unità di deflusso-carbogenation. Il deflusso-carbogenation aiuta a stabilizzare il livello di ossigeno negli esperimenti che si basano sul riciclaggio di un serbatoio di buffer di piccole dimensioni per migliorare l’efficienza dei costi degli esperimenti di droga. Inoltre, il manoscritto presenta esperimenti rappresentativi che esaminano gli effetti di carbogenation diverse modalità e paradigmi di stimolazione sulla plasticità sinaptica attività-dipendente della trasmissione sinaptica.
Introduction
Nel 1951, gli esperimenti di fetta di primo-ha segnalato il cervello acuto erano condotti1. Nel 1971, dopo il successo in vitro registrazioni da piriform corteccia2,3 e la scoperta che i neuroni hippocampal sono interconnessi trasversalmente lungo l’asse di septotemporal di ippocampo4, uno del prime registrazioni in vitro dell’attività di un neurone hippocampal era raggiunto5. La somiglianza dei parametri neurofisiologici o neurostructural dei neuroni in condizioni in vivo e in vitro sono ancora oggetto di qualche dibattito6, ma nel 1975, Schwartzkroin7 ha indicato che il basale Proprietà dei neuroni vengono mantenuti in vitro e che la stimolazione ad alta frequenza (cioè, tetanization) delle afferenze nella formazione hippocampal induce una facilitazione di lunga durata di potenziali sinaptici8. Elettrofisiologici registrazione dell’attività neuronale in vitro notevolmente ampliato lo studio dei meccanismi cellulari di plasticità sinaptica attività-dipendente9,10, che era stata scoperta nel 1973 da Bliss et al. 11 in vivo gli esperimenti con i conigli.
Lo studio di attività neuronale o segnalazione percorsi nelle fette del cervello e soprattutto in fettine ippocampali acute, è ora uno strumento standard. Tuttavia, sorprendentemente, gli esperimenti in vitro hanno ancora essere standardizzati, come testimoniano i diversi approcci che ancora esistono per la preparazione e la manutenzione di fettine ippocampali acute. Reid et al. (1988) 12 recensione le sfide metodologiche per la manutenzione delle fettine di cervello acuto in diversi tipi di fetta alloggiamenti e le scelte di livello medio, pH, temperatura e ossigeno di balneazione. Questi parametri sono ancora difficili da controllare nella camera di registrazione a causa di elementi su misura in vitro fetta-registrazione Setup. Pubblicazioni possono essere trovati che potrebbe contribuire a superare alcune delle sfide metodologiche e che descrivono nuovi tipi di alloggiamenti di fetta di sommersione, come un sistema interstiziale 3D microperfusion13, una camera con maggiore flusso laminare e ossigeno fornire un sistema di registrazione multi-camera16, un sistema con controllo di temperatura computerizzato15e14. Dal momento che queste camere non sono facili da costruire, maggior parte degli scienziati si basano su chambers fetta commercialmente disponibili. Questi alloggiamenti possono essere montati su un sistema di microscopio, consentendo in tal modo la combinazione di elettrofisiologia e fluorescenza imaging17,18,19. Poiché questi alloggiamenti mantenere le fette di cervello immerse in liquido cerebrospinale artificiale (aCSF), un’alta portata della soluzione tampone deve essere mantenuto, aumentando la spesa dell’applicazione della droga. A tal fine, abbiamo incorporato un sistema di perfusione riciclaggio con deflusso-carbogenation che fornisce una stabilità sufficiente per la registrazione a lungo termine dei potenziali di campo in una camera di fetta di sommersione usando un volume relativamente piccolo aCSF. Inoltre, abbiamo riassunto come l’uso di questo sistema sperimentale carbogenation/aspersione influenza il risultato della plasticità sinaptica attività-dipendente10 e come inibizione della chinasi di allungamento eucariotico factor-2 (eEF2K) modula sinaptica trasmissione20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anche se Colombo fetta interfaccia esibiscono più robusto Risposte sinaptiche25,26,27,28, alloggiamenti di sommersione forniscono ulteriore comodità per la registrazione di patch-clamp e fluorescenza di imaging. Così, abbiamo descritto diversi aspetti di field recordings potenziali in fettine ippocampali acute utilizzando una camera di fetta di sommersione commerciale che può essere facilme…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
W.W. condotto, analizzato e progettato gli esperimenti e ha scritto il manoscritto. D.X. e C.P. assistito nella preparazione di figura e condotti gli esperimenti. Questo lavoro è stato supportato da NSFC (31320103906) e 111 Project (B16013) a T.B.
Materials
| Reagents required | |||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019318 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10016318 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10017618 | |
| MgCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10012818 | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10005861 | |
| NaHCO3 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10018960 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10010518 | |
| NaH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20040718 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | A4043 | |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20025118 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019718 | |
| Tools and materials for dissection | |||
| Decapitators | Harvard apparatus | 55-0012 | for rat decapitation |
| Bandage Scissors | SCHREIBER | 12-4227 | for mouse decapitation |
| double-edge blade | Flying Eagle, China | 74-C | |
| IRIS Scissors | RWD, China | S12003-09 | |
| Bone Rongeurs | RWD, China | S22002-14 | |
| Spoon | Hammacher | HSN 152-13 | |
| dental cement spatula | Hammacher | HSN 016-15 | |
| dental double end excavator | Blacksmith Surgical, USA | BS-415-017 | |
| Vibrating Microtome | Leica, Germany | VT1200S | |
| surgical blade | RWD, China | S31023-02 | |
| surgical holder | RWD, China | S32007-14 | |
| Electrophysiology equipment and materials | |||
| Vertical Pipette Puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
| Vibration isolation table | Meirits, Japan | ADZ-A0806 | |
| submerged type recording chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| thermostatic water bath | Zhongcheng Yiqi，China | HH-1 | |
| 4 Axis Micromanipulator | Sutter, USA | MP-285, MP-225 | |
| Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP406 | |
| Amplifier | Molecular Devices, USA | Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices, USA | Digidata 1440A | |
| Anaysis software | Molecular Devices, USA | Clampex 10.2 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon, Japan | FN1 | |
| LED light source | Lumen Dynamics Group, Canada | X-cite 120LED | |
| micropipettes | Harvard apparatus | GC150TF | extracelluar recording |
| borosilicate micropipettes | Sutter, USA | BF150-86 | patch clamp |
| tungsten electrode | A-M Systems, USA | 575500 | |
| peristaltic pump | Longer, China | BT00-300T | |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0309 | 1x inflow, ID: 1.02mm |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0319 | 2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm |
| CCD camera | PCO, Germany | pco.edge sCMOS | |
| lens cleaning paper | Kodak | ||
| 50 ml conical centrifuge tube | Thermo scientific | 339652 | |
| Prechamber | Warner Instruments | BSC-PC | |
| Inline heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
References
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