एक छोटी मात्रा रीसाइक्लिंग में बनाए रखा तीव्र हिप्पोकैम्पस स्लाइस में Synaptic प्लास्टिक रिकॉर्डिंग-, छिड़काव-, और डुबकी-प्रकार चैंबर प्रणाली
Summary
इस प्रोटोकॉल पुनर्नवीनीकरण बफर और जलमग्न तीव्र हिप्पोकैम्पस स्लाइस में गतिविधि पर निर्भर synaptic प्लास्टिक की methodological पहलुओं की एक छोटी मात्रा में ऑक्सीजन स्तर के स्थिरीकरण का वर्णन करता है ।
Abstract
हालांकि मस्तिष्क स्लाइस पर प्रयोगों १९५१ के बाद से उपयोग में किया गया है, समस्याओं रहते हैं कि क्षेत्र की क्षमता या intracellular रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करते समय synaptic संचरण मॉडुलन का एक स्थिर और सफल विश्लेषण को प्राप्त करने की संभावना को कम. इस पांडुलिपि का वर्णन methodological पहलुओं कि तीव्र मस्तिष्क स्लाइस के रखरखाव के लिए प्रयोगात्मक स्थितियों में सुधार लाने में सहायक हो सकता है और एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डुबकी चैंबर में क्षेत्र उत्तेजक postsynaptic क्षमता रिकॉर्डिंग के लिए एक बहिर्वाह-carbogenation इकाई के साथ । बहिर्वाह-carbogenation के प्रयोगों में ऑक्सीजन के स्तर को स्थिर करने में मदद करता है कि एक छोटे से बफर जलाशय के रीसाइक्लिंग पर निर्भर करने के लिए दवा प्रयोगों की लागत क्षमता में वृद्धि । इसके अलावा, पांडुलिपि प्रतिनिधि प्रयोग है कि विभिंन carbogenation मोड और गतिविधि पर उत्तेजना मानदंड के प्रभाव की जांच प्रस्तुत synaptic संचरण की synaptic प्लास्टिक पर निर्भर है ।
Introduction
१९५१ में, पहली रिपोर्ट तीव्र मस्तिष्क टुकड़ा प्रयोगों के1आयोजित किए गए थे । १९७१ में, piriform प्रांतस्था2,3 और खोज है कि हिप्पोकैम्पस ंयूरॉंस septotemporal4, में से एक के हिप्पोकैंपस अक्ष के साथ जुड़े रहे है से इन विट्रो रिकॉर्डिंग में सफल होने के बाद इन विट्रो में सबसे पहले हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन गतिविधि की रिकॉर्डिंग5हासिल किया गया था. neurophysiological की समानता या neurostructural मानकों के तहत न्यूरॉन्स की vivo में और इन विट्रो स्थितियों में अभी भी कुछ बहस6के विषय हैं, लेकिन १९७५ में, Schwartzkroin7 संकेत दिया कि बेसल न्यूरॉन्स के गुण विट्रो में बनाए रखा जाता है और कि उच्च आवृत्ति उत्तेजना (यानी, हिप्पोकैम्पस गठन में afferents के tetanization) synaptic क्षमता8के एक लंबे समय से स्थायी सुविधा लाती है. Electrophysiological इन विट्रो में ंयूरॉन गतिविधि की रिकॉर्डिंग बहुत गतिविधि के सेलुलर तंत्र के अध्ययन-निर्भर synaptic प्लास्टिक9,10है, जो आनंद द्वारा १९७३ में खोज की गई थी का विस्तार एट अल. vivo में खरगोश के साथ प्रयोगों में 11 .
न्यूरॉन गतिविधि या मस्तिष्क स्लाइस में संकेत रास्ते का अध्ययन, और विशेष रूप से तीव्र हिप्पोकैम्पस स्लाइस में, अब एक मानक उपकरण है. हालांकि, हैरत की बात है, इन विट्रो प्रयोगों में अभी तक मानकीकृत किया जा करने के लिए है, के रूप में कई दृष्टिकोण है कि अभी भी तैयारी और तीव्र हिप्पोकैम्पस स्लाइस के रखरखाव के लिए मौजूद द्वारा सबूत । रीड एट अल । (१९८८) 12 स्लाइस कक्षों के विभिन्न प्रकारों और स्नान माध्यम, पीएच, तापमान, और ऑक्सीजन के स्तर के विकल्पों में तीव्र मस्तिष्क स्लाइस के रखरखाव के लिए methodological चुनौतियों की समीक्षा की । इन पैरामीटर्स अभी भी में इन विट्रो स्लाइस रिकॉर्डिंग setups के कस्टम तत्वों के कारण रिकॉर्डिंग चैंबर में नियंत्रण के लिए मुश्किल हैं । प्रकाशनों पाया जा सकता है कि methodological चुनौतियों में से कुछ पर काबू पाने में मदद कर सकते है और इस तरह के एक मध्य 3 डी microperfusion प्रणाली13, बढ़ाया लामिना प्रवाह और ऑक्सीजन के साथ एक चैंबर के रूप में डुबकी टुकड़ा कक्षों के नए प्रकार का वर्णन आपूर्ति14, कंप्यूटरीकृत तापमान नियंत्रण के साथ एक प्रणाली15, और एक बहु-चैंबर रिकॉर्डिंग प्रणाली16। चूंकि इन कक्षों का निर्माण करना आसान नहीं है, इसलिए अधिकांश वैज्ञानिक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्लाइस कक्षों पर निर्भर हैं । इन मंडलों एक खुर्दबीन सिस्टम पर रखा जा सकता है, इस प्रकार इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और प्रतिदीप्ति इमेजिंग17,18,19के संयोजन के लिए अनुमति दी । के बाद से इन कक्षों मस्तिष्क कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (aCSF), बफर समाधान की एक उच्च प्रवाह दर में डूबे स्लाइस रखने की जरूरत है, दवा आवेदन का खर्च बढ़ रही है । यह अंत करने के लिए, हम बहिर्वाह-carbogenation के साथ एक रीसाइक्लिंग छिड़काव प्रणाली है कि एक डुबकी टुकड़ा एक अपेक्षाकृत छोटे aCSF मात्रा का उपयोग कर चैंबर में क्षेत्र क्षमता की दीर्घकालिक रिकॉर्डिंग के लिए पर्याप्त स्थिरता प्रदान करता है शामिल है । इसके अलावा, हम संक्षेप कैसे इस प्रायोगिक carbogenation/छिड़काव प्रणाली के उपयोग गतिविधि के परिणाम पर निर्भर synaptic प्लास्टिक की10 और कैसे युकेरियोटिक बढ़ाव कारक-2 कळेनासे (eEF2K) के निषेध को प्रभावित करता है synaptic ट्रांसमिशन20।
Protocol
Representative Results
Discussion
हालांकि इंटरफेस स्लाइस मंडलों और अधिक मजबूत synaptic प्रतिक्रियाओं25,26,27,28, डुबकी कक्षों पैच-दबाना रिकॉर्डिंग और प्रतिदीप्ति के लिए अतिरिक्त सुविधा प्रदान प?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
W.W. आयोजित, विश्लेषण, और प्रयोगों डिजाइन और पांडुलिपि लिखा था । D.X. और C.P. चित्रा तैयारी में सहायता प्रदान की है और प्रयोगों का आयोजन किया । यह काम NSFC (३१३२०१०३९०६) और १११ परियोजना (B16013) द्वारा समर्थित किया गया था T.B.
Materials
| Reagents required | |||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019318 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10016318 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10017618 | |
| MgCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10012818 | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10005861 | |
| NaHCO3 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10018960 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10010518 | |
| NaH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20040718 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | A4043 | |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20025118 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019718 | |
| Tools and materials for dissection | |||
| Decapitators | Harvard apparatus | 55-0012 | for rat decapitation |
| Bandage Scissors | SCHREIBER | 12-4227 | for mouse decapitation |
| double-edge blade | Flying Eagle, China | 74-C | |
| IRIS Scissors | RWD, China | S12003-09 | |
| Bone Rongeurs | RWD, China | S22002-14 | |
| Spoon | Hammacher | HSN 152-13 | |
| dental cement spatula | Hammacher | HSN 016-15 | |
| dental double end excavator | Blacksmith Surgical, USA | BS-415-017 | |
| Vibrating Microtome | Leica, Germany | VT1200S | |
| surgical blade | RWD, China | S31023-02 | |
| surgical holder | RWD, China | S32007-14 | |
| Electrophysiology equipment and materials | |||
| Vertical Pipette Puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
| Vibration isolation table | Meirits, Japan | ADZ-A0806 | |
| submerged type recording chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| thermostatic water bath | Zhongcheng Yiqi，China | HH-1 | |
| 4 Axis Micromanipulator | Sutter, USA | MP-285, MP-225 | |
| Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP406 | |
| Amplifier | Molecular Devices, USA | Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices, USA | Digidata 1440A | |
| Anaysis software | Molecular Devices, USA | Clampex 10.2 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon, Japan | FN1 | |
| LED light source | Lumen Dynamics Group, Canada | X-cite 120LED | |
| micropipettes | Harvard apparatus | GC150TF | extracelluar recording |
| borosilicate micropipettes | Sutter, USA | BF150-86 | patch clamp |
| tungsten electrode | A-M Systems, USA | 575500 | |
| peristaltic pump | Longer, China | BT00-300T | |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0309 | 1x inflow, ID: 1.02mm |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0319 | 2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm |
| CCD camera | PCO, Germany | pco.edge sCMOS | |
| lens cleaning paper | Kodak | ||
| 50 ml conical centrifuge tube | Thermo scientific | 339652 | |
| Prechamber | Warner Instruments | BSC-PC | |
| Inline heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
References
- McIlwain, H. Metabolic response in vitro to electrical stimulation of sections of mammalian brain. Biochem J. 48 (4), (1951).
- McIlwain, H., Richards, C. D., Somerville, A. R. Responses in vitro from the piriform cortex of the rat, and their susceptibility to centrally-acting drugs. J Neurochem. 14 (9), 937-938 (1967).
- Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. J Neurochem. 13 (12), 1333-1343 (1966).
- Andersen, P., Bliss, T. V., Lomo, T., Olsen, L. I., Skrede, K. K. Lamellar organization of hippocampal excitatory pathways. Acta Physiol Scand. 76 (1), 4-5 (1969).
- Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Res. 35 (2), 589-593 (1971).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).
- Schwartzkroin, P. A. Characteristics of CA1 neurons recorded intracellularly in the hippocampal in vitro slice preparation. Brain Res. 85 (3), 423-436 (1975).
- Schwartzkroin, P. A., Wester, K. Long-lasting facilitation of a synaptic potential following tetanization in the in vitro hippocampal slice. Brain Res. 89 (1), 107-119 (1975).
- Reymann, K. G., Frey, J. U. The late maintenance of hippocampal LTP: requirements, phases, ‘synaptic tagging’, ‘late-associativity’ and implications. Neuropharm. 52 (1), 24-40 (2007).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. Synaptic plasticity in health and disease: introduction and overview. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1633), 20130129 (2014).
- Bliss, T. V., Gardner-Medwin, A. R. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the unanaestetized rabbit following stimulation of the perforant path. J Physiol. 232 (2), 357-374 (1973).
- Reid, K. H., Edmonds, H. L., Schurr, A., Tseng, M. T., West, C. A. Pitfalls in the Use of Brain-Slices. Prog Neurobiol. 31 (1), 1-18 (1988).
- Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability. J Neurosci Methods. 180 (2), 243-254 (2009).
- Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
- Redondo, R. L., et al. Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation. J Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).
- Stopps, M., et al. Design and application of a novel brain slice system that permits independent electrophysiological recordings from multiple slices. J Neurosci Methods. 132 (2), 137-148 (2004).
- Behnisch, T., Matsushita, S., Knopfel, T. Imaging of gene expression during long-term potentiation. Neuroreport. 15 (13), 2039-2043 (2004).
- Karpova, A., et al. Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus. Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).
- Karpova, A., Mikhaylova, M., Thomas, U., Knopfel, T., Behnisch, T. Involvement of protein synthesis and degradation in long-term potentiation of Schaffer collateral CA1 synapses. J Neurosci. 26 (18), 4949-4955 (2006).
- Weng, W., Chen, Y., Wang, M., Zhuang, Y., Behnisch, T. Potentiation of Schaffer-Collateral CA1 Synaptic Transmission by eEF2K and p38 MAPK Mediated Mechanisms. Front Cell Neurosci. 10 (247), (2016).
- Meduna, L. J., Jackman, A. I. Carbon dioxide inhalation therapy. Res Publ Assoc Res Nerv Ment Dis. 31, 280-286 (1953).
- Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J Vis Exp. (49), (2011).
- Yuanxiang, P., Bera, S., Karpova, A., Kreutz, M. R., Mikhaylova, M. Isolation of CA1 nuclear enriched fractions from hippocampal slices to study activity-dependent nuclear import of synapto-nuclear messenger proteins. J Vis Exp. (90), e51310 (2014).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J Neurosci Meth. 130 (1), 19-32 (2003).
- Kloosterman, F., Peloquin, P., Leung, L. S. Apical and basal orthodromic population spikes in hippocampal CA1 in vivo show different origins and patterns of propagation. J Neurophysiol. 86 (5), 2435-2444 (2001).
- Thiemann, W., Malisch, R., Reymann, K. G. A new microcirculation chamber for inexpensive long-term investigations of nervous tissue in vitro. Brain Res Bull. 17 (1), 1-4 (1986).
- Shetty, M. S., et al. Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents. J Vis Exp. (103), (2015).
- Du, H., Lin, J., Zuercher, C. Higher efficiency of CO2 injection into seawater by a venturi than a conventional diffuser system. Bioresour Technol. 107, 131-134 (2012).
- Weinman, J., Mahler, J. An Analysis of Electrical Properties of Metal Electrodes. Med Electron Biol Eng. 2, 299-310 (1964).
- Fanselow, M. S., Dong, H. W. Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures. Neuron. 65 (1), 7-19 (2010).
- Wang, M., et al. Translation of BDNF-gene transcripts with short 3′ UTR in hippocampal CA1 neurons improves memory formation and enhances synaptic plasticity-relevant signaling pathways. Neurobiol Learn Mem. , (2016).
