Génération indépendante et dépendante de la sélection de CRISPR / Cas9-Meded Knockouts dans les cellules de mammifères

Les modifications génétiques stables offrent un avantage sur les méthodes transitoires de perturbation cellulaire, qui peuvent être variables dans leur efficacité et leur durée. L'édition génomique est devenue de plus en plus courante ces dernières années en raison du développement de nucléases spécifiques cibles, telles que les nucléases ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} , les nucléases effectrices de l'activateur de la transcription (TALEN) ^{6 , 7 , 8 , 9} Et des nucléases guidées par l'ARN dérivées du système de répétitions palindromiques courtes (CRISPR) regroupées, régulièrement intercalées ¹⁰ .

La machine d'édition CRISPR / Cas9 est adaptée d'un système immunitaire que les bactéries et les archées utilisent pour se défendre contre les infections viralesAss = "xref"> 11 ^{, 12 , 13} . Dans ce processus, des fragments courts de 20-30 nt de séquence virale envahissante sont incorporés dans un locus génomique comme des "entretoises" flanqués par des unités répétitives ^{14 , 15} . La transcription subséquente et le traitement de l'ARN génèrent de petits ARN ¹⁶ associés à CRISPR (crRNAs) qui, conjointement avec un CRRNA ¹⁷ trans-activant (tracrRNA), assemblent avec l'endonucléase Eff9 Cas9. Les crRNAs fournissent donc une spécificité au ciblage Cas9, guidant le complexe pour cliver des séquences d'ADN virales complémentaires et prévenir d'autres infections ^{18 , 19} . Toute séquence "protospacer" dans l'ADN ciblé peut servir de source de l'ARNrm, pourvu qu'elle soit directement à 5 'd'un motif adjacent de protospacer court (PAM), NGG dans le cas de S. pyogenes Cas9 <sUp class = "xref"> 20. L'absence de la séquence PAM près de l'espaceur dans le locus CRISPR de l'hôte se distingue entre soi-même et non-soi, empêchant le ciblage de l'hôte. En raison de son universalité et de sa flexibilité, ce système biologique a été puissamment adapté pour l'édition génomique, de telle sorte que presque n'importe quel site d'ADN adjacente au PAM peut être ciblé. Dans cette version, une autre modification a fusionné le crRNA et l'ARNt de trac en un seul composant guide RNA (sgRNA) qui est chargé dans la protéine Cas9 ²¹ .

Lors de l'expression de Cas9 et d'un sgRNA dans des cellules eucaryotes, la protéine Cas9 clive les deux brins d'ADN au locus ciblé. En l'absence d'une région appropriée de séquence homologue, la cellule corrige cette rupture par l'intermédiaire d'une jointure finale non homologue (NHEJ) ^{22 , 23 , 24} , qui introduit typiquement de petites deletions ou, rarement, des insertions. Lorsque vous ciblez unCadre de lecture, la réparation entraîne probablement un changement de cadre translationnel qui produit un produit protéique non fonctionnel. En revanche, lorsqu'elle est munie d'un modèle exogène avec de grandes régions d'homologie, la cellule peut réparer la rupture à double brin par une réparation dirigée par homologie ^{25 , 26} . Cette voie permet des deletions, des remplacements ou des insertions plus importantes dans le génome, associées à l'introduction de marqueurs de sélection excisables ²⁷ .

Ici, nous présentons des protocoles pour générer des lignées cellulaires knock-out par l'une ou l'autre de ces deux méthodes CRISPR / Cas9 ( Figure 1A ). L'approche NHEJ utilise un seul site de coupe de sgRNA et un dépistage indépendant de la sélection, et nécessite donc une préparation précieuse. Lors de l'utilisation de cette méthode, il convient de concevoir des ARN de guide complémentaires aux exons près de la fin de la transcription 5 ', qui sont les plus susceptibles de produire un knock-out. Depuis le modificatLes ions du génome dans ce cas sont petits, le dépistage des clones knock-out est basé sur des transferts de points, où le produit protéique est évalué à haut débit. Nous utilisons par exemple la génération de liaisons knock-out ELAV-like 1 (ELAVL1). La deuxième approche repose sur la réparation dirigée par homologie (HDR) et utilise deux sites de sgRNA coupés qui couvrent le gène ou la région d'intérêt, ce qui permet de supprimer des dizaines de kb. Un plasmide avec deux régions d'homologie qui flanquent les sites de clivage fournit un modèle de remplacement ( Figure 1B ), en introduisant un marqueur de résistance sélectionnable qui augmente l'efficacité de la génération de knock-out. Cette méthode peut également être adaptée pour introduire des modifications de gènes avec des bras d'homologie correctement conçus. Dans ce cas, l'intégration d'un nouveau fragment d'ADN permet un dépistage par PCR ( Figure 1C ). Ici, nous utilisons la génération des lignes knock-out 2 de la famille de liaison Pumilio RNA (PUM2) à titre d'exemple.