Summary

Selezione-dipendente e generazione indipendente di CRISPR / Cas9-mediata Gene Knockouts nelle cellule di mammiferi

Published: June 16, 2017
doi:

Summary

I recenti progressi nella capacità di manipolare geneticamente le linee cellulari somatiche hanno un grande potenziale per la ricerca di base e applicata. Qui presentiamo due approcci per la produzione e lo screening generati da CRISPR / Cas9 nelle linee cellulari mammiferi, con e senza l'uso di marcatori selectable.

Abstract

Il sistema di ingegneria del genoma CRISPR / Cas9 ha rivoluzionato la biologia permettendo di modificare il genoma in modo preciso e con poco sforzo. Guidato da una singola guida RNA (sgRNA) che conferisce specificità, la proteina Cas9 ferma entrambi i fili di DNA nel luogo di destinazione. La rottura del DNA può scatenare un collegamento non terminale (NHEJ) o una riparazione diretta (HDR) omologica. NHEJ può introdurre piccole delezioni o inserzioni che portano a mutazioni di fotogrammi, mentre HDR consente perturbazioni più grandi e più precise. Qui presentiamo i protocolli per la generazione di linee di cellule di knockout accoppiando i metodi CRISPR / Cas9 stabiliti con due opzioni per la selezione / screening a valle. L'approccio NHEJ utilizza un singolo sito di taglio sgRNA e uno screening indipendente dalla selezione, in cui la produzione di proteine ​​viene valutata mediante immunoblot dot in modo ad alto rendimento. L'approccio HDR utilizza due siti di taglio sgRNA che spaziano sul gene di interesse. Insieme a un modello HDR fornito, questo metodo può raggiungere la cancellazioneDi decine di kb, aiutato dal marker di resistenza selezionabile inserito. Vengono discusse le opportune applicazioni ei vantaggi di ciascun metodo.

Introduction

Le alterazioni genetiche stabili offrono un vantaggio rispetto ai metodi transitori di perturbazione cellulare, che possono essere variabili nella loro efficienza e durata. L'editing genomico è diventato sempre più comune negli ultimi anni a causa dello sviluppo di nucleasi specifiche di target, quali le nucleasi di zinco-dito , 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , nucleasi efficace (TALEN) simili all'attivatore di trascrizione 6 , 7 , 8 , 9 E nucleasi guidate da RNA derivate dal sistema di ripetizioni palindromiche corte (CRISPR) regolarmente interspaziate in cluster 10 .

La macchina di montaggio CRISPR / Cas9 è adattata da un sistema immunitario che batteri e archea usano per difendersi dalle infezioni viraliAss = "xref"> 11 , 12 , 13 . In questo processo, brevi, 20-30 nt frammenti di sequenza virale invasiva sono incorporati in un locus genomico come "distanziatori" fiancheggiati da unità ripetitive 14 , 15 . La successiva trascrizione e l'elaborazione di RNA generano piccoli RNA 16 associati a CRISPR (crRNAs) che, insieme a un crRNA trans-attivante 17 (tracrRNA), si riuniscono con l'endonucleasi efficace Cas9. I crRNA forniscono quindi la specificità per il targeting di Cas9, guidando il complesso per sequestrare sequenze DNA complementari virali e prevenire ulteriori infezioni 18 , 19 . Ogni sequenza "protospacer" nel DNA mirato può servire come fonte del CRRNA, purché sia ​​direttamente 5 'a un breve motivo adiacente protospacer (PAM), NGG nel caso di S. pyogenes Cas9 <sUp class = "xref"> 20. L'assenza della sequenza PAM vicino al distanziatore nel loco CRISPR dell'host distingue tra auto e non-auto, impedendo il targeting dell'host. A causa della sua universalità e flessibilità, questo sistema biologico è stato fortemente adattato per l'editing genomico, in modo che quasi tutti i siti adiacenti del PAM possano essere mirati. In questa versione, un'ulteriore modifica ha fuso la crRNA e la tracrRNA in un singolo componente RNA (sgRNA) guida che è caricato nella proteina Cas9 21 .

Dopo l'espressione di Cas9 e di un sgRNA nelle cellule eucariotiche, la proteina Cas9 elimina entrambi i fili di DNA nel luogo di destinazione. In assenza di una regione adatta di sequenza omologa, la cella risolve questa rottura mediante l'adesione finale non omologica (NHEJ) 22 , 23 , 24 , che presenta tipicamente piccole delezioni o, raramente, inserzioni. Quando si punta ad un apertoLa riparazione probabilmente porta ad un frameshift traslatorio che produce un prodotto proteico non funzionale. Al contrario, quando è dotato di un modello esogeno con grandi regioni di omologia, la cellula può fissare la rottura a doppio filamento con la riparazione diretta dell'omologia 25 , 26 . Questo percorso consente di eliminazioni, sostituzioni o inserzioni nel genoma più precise, accoppiato con l'introduzione di marcatori di selezione accisa 27 .

Qui presentiamo i protocolli per la generazione di linee di cellule di knockout mediante uno di questi due metodi CRISPR / Cas9 ( Figura 1A ). L'approccio NHEJ utilizza un unico sito taglio sgRNA e uno screening indipendente dalla selezione, e quindi richiede una piccola preparazione anticipata. Quando si utilizza questo metodo, devono essere progettati i RNA complementari agli esoni prossimi all'estremità 5 della trascrizione, che sono più probabili a produrre un eliminazione. Dal momento che il modificatoGli ioni al genoma in questo caso sono piccoli, lo screening per i cloni di knockout si basa su macchie dot, dove il prodotto proteico viene valutato in modo ad alto rendimento. Ad esempio, usiamo la generazione di linee di eliminazione di ELAV come proteine ​​1 (ELAVL1). Il secondo approccio si basa sulla riparazione diretta dell'omologia (HDR) e utilizza due siti di taglio sgRNA che spaziano il gene o regione di interesse, consentendo la cancellazione di decine di kb. Un plasmide con due regioni di omologia che fiancheggiano i siti di scissione fornisce un modello di sostituzione ( Figura 1B ), introducendo un marker di resistenza selezionabile che aumenta l'efficienza della generazione di eliminazione. Questo metodo può anche essere adattato per introdurre modifiche geniche con armi di omologia adeguatamente progettate. In questo caso, l'integrazione di un nuovo frammento di DNA consente di effettuare uno screening basato su PCR ( Figura 1C ). Ad esempio, usiamo la generazione di linee di eliminazione di Pumilio RNA 2 (PUM2).

Protocol

1. Identificazione delle regioni di omologia intorno alla desinenza desiderata NOTA: necessaria solo se si utilizza la modifica basata su selezione. Selezionare due regioni, inizialmente 1.5-2 kb, da entrambi i lati del locus di deselezione desiderato, che servirà come armi di omologia nel modello HDR ( Figura 1A ). Identificare le regioni che non dispongono di siti di riconoscimento BsaI su uno strato (GGTCTC) per facilitare la clonazione. Se i siti…

Representative Results

Per la generazione di linee di eliminazione ELAVL1, è stato disponibile un anticorpo robusto, in modo da eseguire la modifica usando sgRNA singoli ( figura 1A , sinistra), seguita da immunoblot dot. Tre sgRNAs sono stati trasfettati in modo indipendente per confrontare efficienze e per escludere gli effetti target nei cloni risultanti. Dopo aver raccolto e blottato i lisati delle cellule dalle popolazioni clonali su due membrane di nitrocellulosa, le macchi…

Discussion

Il sistema CRISPR / Cas9 ha permesso un'efficace generazione di modifiche genomiche stabili, che forniscono un'alternativa più coerente ad altri metodi di manipolazione transitoria. Ecco, abbiamo presentato due metodi per la rapida identificazione dei colpi di origine CRISPR / Cas9 nelle linee cellulari di mammiferi. Entrambi i metodi richiedono un piccolo materiale cellulare, pertanto i test possono essere eseguiti nelle fasi iniziali della coltura clonale, risparmiando tempo e reagenti. Per aumentare l'ef…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori vorrebbero riconoscere Gissell Sanchez, Megan Lee e Jason Estep per l'assistenza sperimentale, e Weifeng Gu e Xuemei Chen per la condivisione di reagenti.

Materials

Competent E. coli cells
plasmid prep kit
pSpCas9(BB) plasmid Addgene 42230 Ran et al 2013, cloning sgRNAs
BbsI enzyme ThermoFisher FD1014 Ran et al 2013, cloning sgRNAs
T7 DNA ligase NEB M0318L Ran et al 2013, cloning sgRNAs
Tango Buffer ThermoFisher BY5 Ran et al 2013, cloning sgRNAs
PlasmidSafe exonuclease Epicentre E3105K Ran et al 2013, cloning sgRNAs
Q5 hot start high fidelity polymerase NEB M0494A HA amplification
pUC19-BsaI Modified pUC19 plasmid, mutated existing BsaI site and inserted two outward facing BsaI sites after BamHI/EcoRI digestion
pGolden-Neo Addgene 51422 Resistance cassette
pGolden-Hygro Addgene 51423 Resistance cassette
BsaI enzyme NEB R3535S Homology arm contruction
T7 DNA ligase NEB M0318L
PlasmidSafe exonuclease Epicentre E3105K
Toothpicks bacterial PCR
Taq polymerase bacterial colony PCR
HEK293 human cells
DMEM Corning 10-013-CV
FBS Corning MT35010CV
Penicillin-Strep (opt.) Gibco 15140-122
6 well plates BioLite 12556004
TransIT-LTI Transfection Reagent Mirus MIR2300 for lipofection only
Opti-MEM ThermoFisher 31985062 for lipofection only
G418 (Neomycin) Sigma Aldrich A1720-5G
Hygromycin Sigma Aldrich H3274-250MG
96 well plates ThermoFisher 12556008
Passive Lysis Buffer, 5x Promega
1xSDS loading buffer recipe decribed in protocol
Nitrocellulose Membrane Bio-Rad 162-0115
TBST recipe decribed in protocol
Dehydrated milk
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ThermoFisher 34075 for HRP-conjugated secondary antibodies
Extracta DNA prep for PCR Quantabio 95091-025
KOD polymerase Novagen 71316

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Cite This Article
Sternburg, E. L., Dias, K. C., Karginov, F. V. Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (124), e55903, doi:10.3791/55903 (2017).

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